原代细胞分离技术

　　取人或动物体内(或胚胎)的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用的如下方法进行分离培养：

　　一、悬浮细胞的分离方法

　　1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。

　　2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。

　　3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。

　　4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。

　　二、实体组织材料的分离方法

　　(一)机械分散法

　　1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。

　　2、用PBS清洗两次后

　　①用吸管吹打，分散组织细胞。

　　②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出。

　　③或在不锈钢纱网内用钝物(注射器钝端)压挤使细胞从网孔中压挤出。

　　3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。

　　4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。

　　(二)消化分离法

　　1、酶消化分离法(过夜冷消化法)

　　①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。

　　②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。

　　③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。

　　④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。

　　⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。

　　2、非酶消化法(EDTA消化法)

　　①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。

　　②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。

　　③加入消化液(胰蛋白酶或胶原酶或EDTA)于37℃水浴中作用适当时间(中间可轻摇1~2次)，若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。

　　④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。

　　⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。