真菌和细菌感染快速检测 SLP Reagent Set

家蚕的淋巴有一种自我保护机制，被称为“酚氧化酶原串联反应”。当受外界入侵（如细菌和真菌）时，这个串联反应参与黑色素的形成并使机体免受攻击。这个反应由细菌中的肽聚糖或是真菌、酵母中的(1→3)-β-D-葡聚糖引发，该反应中的酚氧化酶原被激活。也有人认为丝氨酸蛋白酶也参与了该反应，但是没有从这方面阐述的资料。
已消毒的SLP包括了所有参与该反应的因子，再生后的溶液中含有L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-3,4-dihydroxyphenylalanine, DOPA)，该物质可以作为肽聚糖或β-葡聚糖所激发的酚氧化酶的底物，DOPA被酚氧化酶氧化，形成黑色素。肽聚糖是绝大多数细菌细胞壁的组成成分，而β-葡聚糖广泛的分布于真菌的细胞壁中。因此，SLP通过测定黑色素的形成情况，进而定性或定量检测细菌和真菌的污染。
特点
1. 用于肽聚糖和(1→3)-β-D-葡聚糖的定量检测，检测敏感。
2. 使用酶标仪或内毒素检测仪，能对肽葡聚糖和β-葡聚糖精确定量。
3. 不需任何特殊器械即可通过肉眼检测出细菌和真菌的污染。
4. 冻干SLP的在2-10℃至少可保存18个月。
原理见：http://www.cxbio.com/news/news_details.asp?id=9588
当使用酶标仪或内毒素检测仪时，通过测定反应的始动时间和由颜色变化而导致的吸光度的变化，即可对肽聚糖或β-葡聚糖进行定量。
所含试剂（所有试剂均存放于2-10℃）：
1. 冻干SLP             for 3ml
  使用酶标仪或者目测约50Test，使用内毒素检测仪约30Test
 2. 冻干底物             for 3ml
  含有作为酚氧化酶底物的DOPA
3. 稀释液           4ml
  含有good’s buffer
试剂准备：
(A) 底物中加入3ml稀释液，轻轻摇晃至底物完全溶解，注意避免碰到橡胶帽。
(B) 所有底物溶液加入冻干的SLP中，轻轻摇晃至SLP完全溶解，同样，注意避免碰到橡胶帽。此溶液即为SLP检测液。
操作步骤
1.  使用酶标板(微孔板)目测
(A) 分别稀释肽聚糖和β-葡聚糖参照物，做两个不同浓度的参照系列，每孔加入0.05ml的参照物稀释液

或者待测样品
(B) 每孔加入0.05mlSLP检测液
(C) 温和摇晃后，酶标板于30℃孵育一小时
(D) 肉眼判断：反应液中有黑色素生成的为阳性，其它的为阴性。
(E) 参考物的最低浓度（即能生成黑色素的最小浓度）不应在SLP检测液的最低检测浓度以下。
(F) 样品中SLP反应物浓度是否在SLP检测液浓度的最低检测范围内，决定了样品是阳性或阴性。
2. 使用酶标仪检测
(A) 样品和参考物的稀释系列各0.05ml分别加入酶标板孔中
(B) 迅速在每孔中加入0.05mL SLP检测液。最好用消毒过的加液器。
(C) 在以下条件下使用酶标仪上测定光吸收值：
      检测波长：  650nm
      检测模式：  动态检测
      反应时间：  90分钟
      检测温度：  30℃
      自动混匀：  一次
(D) 绘制双对数回归(regression of Log-Log)标准曲线，横轴为SLP参考物的浓度，坚轴为反应时间
(E) 通过标准曲线上的反应始动时间，计算SLP反应物质的浓度。
3. 使用内毒素检测仪做SLP检测，其操作步骤可以按照仪器生产商提供的操作手册中所述的细菌内毒素检测方法操作。内毒素检测仪可能会发出反应混合液缺乏透射光的信号。忽视这个的警告，测定结果不会受此影响。
关联试剂：
297-51501   SLP Reagent Set    （定量的需要另配以下标准品使用）
162-18101   Peptidoglycan, from Micrococcus luteus肽聚糖    2ml
030-09903   Curdlan  (1→3)-β-D-葡聚糖    1g
注意事项
1. 器械应250℃干热灭菌至少2小时，并避免被SLP反应物污染
2. SLP冻干粉溶解后，其溶液应存于0-4℃,并尽早使用
3. 注意在器械储存期间避免其被SLP反应物质污染
4. SLP检测液的敏感性很大程度上受离子强度的影响
5. 该试剂盒仅用于研究，不可用于诊断；仅用于体外，不可用于人或动物体内。
（本资料只供参考，以原包装说明书为准）
常见使用说明：
1.      因为SLP是被PG（肽聚糖）或BG[(1→3)-β-D-葡聚糖]所引发，在操作和使用本试剂时，单一灭菌器皿或者使用无热源器皿都不够的，必须还要同时无PG和BG；
2.      如果是用玻璃器皿，清洗干净后，需要在250度下干热灭菌2小时；
3.      如果是一次性无菌器皿，在使用之前必须进行测试能否适用于此项检测（即注1）；
4.      如果使用过后还有剩余，我们认为其很可能被样品污染，不建议继续使用。以前我们也遇到类似的问题，但所有的都是因为污染造成。如果用户一定要保留一些SLP溶液，建议在未使用前进行无菌分装并0-4℃保存；最好是将SLP冻干粉在无菌无污染条件下，按照使用计划量预先分装后0-4℃保存。

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