番茄转录因子SlHZ24通过对D-甘露糖/L半乳糖通路的正调节 促进抗坏血酸积累

上一篇 / 下一篇  2018-04-28 09:35:52/ 个人分类：蛋白互作研究

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文献来源：The tomato HD-Zip I transcription factor SlHZ24 modulates ascorbate accumulation through positive regulation of the D-mannose/L-galactose pathway.The Plant Journal（IF5.901）

关键技术：酵母单/双杂交、双萤光素酶报告基因检测、EMSA

番茄转录因子SlHZ24通过对D-甘露糖/L半乳糖通路的正调节促进抗坏血酸积累

研究背景
　　抗坏血酸（AsA）一种抗氧化剂，可以清除植物在胁迫条件下产生的活性氧。本文通过酵母单杂交技术、瞬时表达和EMSA实验验证了SlHZ24和SIGMP3启动子结合，且SlHZ24表达水平与AsA积累呈正相关特性。相反，通过RNAi技术导致AsA表达量降低。SlHZ24同时也影响D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达，如SIGME2、SIGGP和SIGMP4，说明抗坏血酸合成为多靶点调控。SlHZ24过表达植株对氧化应激的敏感性降低，作者推断SlHZ24促进抗坏血酸的合成，提高了植株对氧化应激的耐受性。

研究内容
1.SlHZ24属于HD-Zip I蛋白家族
　　本文以维生素C合成的D-mannose/L-galactose途径中关键GMP基因为切入点。GDP-D甘露糖焦磷酸化酶（GMP）在D-甘露糖/L半乳糖通路中扮演了重要的角色，据报道GMP家族中只有过表达SIGMP3提高了抗坏血酸的表达且改善了氧化应激耐受性。因此，本文使用酵母单杂交找寻与SIGMP3启动子作用调节抗坏血酸的转录因子，共找到25个潜在蛋白，确认SlHZ24 为研究对象。序列分析显示SlHZ24含有HD和LZ结构域（图1a），且与其他HD-Zip I蛋白高度同源（图1b）。进化分析的结果也说明SlHZ24与拟南芥的HD-Zip I蛋白同源。因此，SlHZ24属于HD-Zip I蛋白。
 

2.酵母单/双杂交验证SlHZ24反式激活作用
　　酵母双杂交验证了SlHZ24反式激活，含pBD-SlHZ24的实验组可在SD/–Trp–His–Ade平板上生长，而对照组不生长（图2a）。酵母单杂交验证了不同长度SlHZ24和SIGMP3启动子的作用，其中SlHZ24全长、N3、N4、N5、N6、N7包含HD结构域表现为正常生长，N1不包含HD结构域表现为细胞不生长，N2包含不完整的HD结构域表现为生长缓慢，说明HD结构域为互做结构域（图2a）。
 
3. 瞬转及双萤光素酶检测验证SlHZ24与SlGMP3启动子结合
　　将SlGMP3启动子分成4段进行双萤光素酶检测实验（图3a、3b），P1和P2启动子区域检测到荧光增强，实验结果说明SlHZ24结合SlGMP3启动子的第二段序列，即-2411到-2313bp为结合区段。
 

4．进一步验证SlHZ24和SlGMP3结合
　　酵母单杂交验证不同的SlGMP3启动子和SlHZ24的结合情况（图4a），结果显示SlHZ24蛋白与SlGMP3启动子的结合位点为-2411到-2313bp，突变实验（图4b）、EMSA实验（图4c）也证实了这点。这些结果表明SlHZ24直接与SlGMP3的上游元件结合来启动下游表达。
 

5. 不同番茄组织及转基因番茄中SlGMP3和SlHZ24检测
       使用qPCR对番茄不同组织中的SlGMP3启动子和SlHZ24的表达量进行了检测，发现两者都在茎和叶总的表达量较高（图5a），说明SlHZ24正向调节SlGMP3表达。为了验证SlHZ24对SlGMP3的影响，分别建立的SlHZ24过表达和干扰转基因番茄进行下一步实验（图5b）。
 

6. SlHZ24通过调节SlGMP3表达来改变AsA的合成
       对过表达、干扰番茄叶及果实中AsA的检测（图6a 、6b）实验，说明SlHZ24在番茄叶和果实中同时调节抗坏血酸的合成。过表达SlHZ24的OX-13植株果实中SlGMP3基因的表达量明显高于野生型，而干扰SlHZ24的KD-9植株果实中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6d）。有趣的是在干扰SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量显著减少，而过表达SlHZ24的植株叶子中SlGMP3基因的表达量变化不大（图6c）。对转基因番茄中其他GMP家族基因的检测结果说明SlHZ24可能调节多种SIGMP基因（图6c、图6d）。
 

7. 番茄中AsA和SlGMP3检测
        为了检测番茄果实成熟过程中SlHZ24如何影响SlGMP3，对不同时期果实的AsA和SlGMP3表达量进行了检测（图7a、7b），结果表明SlHZ24在番茄成熟的过程中可以调节SlGMP3的表达，其中以破色期果实调控效应最为显著，除了红果实成熟期。
 

8. SlHZ24转基因番茄中D-甘露糖/L半乳糖通路其他基因的表达检测
        使用qPCR对番茄的叶和果实进行了检测（图8a、8b），结果表明在野生型和转基因番茄中SIGME2、SIGGP基因表达量发生了改变，显示SlHZ24的多点协同调控作用。
 

9. SIGME2、SIGGP启动子实验
        使用EMSA实验验证转录因子SlHZ24和启动子SIGME2、SIGGP有互做关系。
 
10. SlHZ24光响应及氧化应激的作用
        为了研究光对AsA的作用，作者对不同光处理番茄中的AsA和SIHZ24的表达量进行了检测（图10a、10b），结果表明SIHZ24可以被光激活且AsA的表达也随之提高。使用MV对转基因番茄进行处理，同时对叶绿素和MDA浓度进行检测，说明SIHZ24过表达可以提高植物对氧化应激的耐受性。
 

文章小结
    目前植物合成AsA基础途径已经明确，但对AsA合成代谢的调控机制知之甚少。本文研究了番茄转录因子SlHZ24结合SIGMP3启动子从而增加AsA表达水平的机制，进而提高植物对氧化应激的耐受性。AsA（又称维C），是生物体一类小分子抗氧化剂物质，能清除体内活性氧，增强有机体抗氧化能力，保证新陈代谢正常进行。不过人类自身不能合成维C，必须从食物中摄取。本研究首次发现调控果实AsA积累的转录因子，对揭示AsA调控机制和未来品质改良具有重要意义。

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TAG: emsa双萤光素酶

 

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