基因芯片技术的概念及制作方法

　　内容摘要：机械点样法利用电脑控制的机械手，按设定的方案将预先合成好的探针、cDNA或基因组DNA准确快速地定量点样于支持物的相应位置上，再用紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。每块芯片可含探针点数千至上万个。随着机械和制作水平的提高，点样法制作芯片的密度还可望有较大的提高。

　　(一)制作方法

　　1.原位光刻合成法该法是由美国著名的Affymetrix公司率先开发的寡聚核苷酸光刻专利技术，是生产高密度寡核苷酸基因芯片的核心关键技术。其原理是利用光刻合成反应，以经过修饰具有末端带光敏保护基团的亚磷酰胺(A、G、C、T)为原料，根据需要合成的核苷酸序列，用特制的光刻掩膜或者用激光定时定点地控制载体上光照的位点，从而指导寡核苷酸探针在片基上的合成，制成基因芯片，如图6—3所示。其合成过程如下。

　　①在经过处理的玻片表面铺上一层连接分子(1inker)，即使支持物羟基化，并用光敏保护基团将羟基保护起来，加上的光敏保护基团可利用光照射而除去。分别用不同的蔽光膜(光刻掩膜)(phot01ithographic mask)保护不需合成的部位，使其不透光，而暴露需要聚合的位，使其透光。光通过蔽光膜照射到支持物上，受光部位的羟基脱去保护基团而被活化，成为游离羟基。

　　②按设定的顺序将具有保护基团的亚磷酰胺原料中的任意一种铺过片基，进入到活性位点的原料受光照作用，末端脱去保护，并与游离羟基结合，从而在片基上连上了第一个某种单核苷酸。更换光刻掩膜和亚磷酰胺原料，同上操作，在不同位点接上其他3种单核苷酸。经过4次上述两步骤，就在片基按预先设计的方案将4种单核苷酸分别固定在不同的位点上，完成了各个寡核苷酸探针第一位单核苷酸的合成。随后对各固定的单核苷酸羟基加帽、氧化和冲洗，为其羟基加上保护，为下一步骤的合成做准备。至此，芯片寡核苷酸原位合成的第一次循环完成。按同样的方法和步骤进行循环操作，可以合成核苷酸长度等于循环次数的寡核苷酸探针。原位合成含有n个单核苷酸的寡核苷酸片段，需要经过n个循环和4n次上述化学步骤，可以产生4”种可能结构的寡核苷酸探针，几乎可得到全部可能序列组成的探针。

　　2.机械点样法利用电脑控制的机械手，按设定的方案将预先合成好的探针、cDNA或基因组DNA准确快速地定量点样于支持物的相应位置上，再用紫外线交联固定后即得到DNA微阵列或芯片。每块芯片可含探针点数千至上万个。随着机械和制作水平的提高，点样法制作芯片的密度还可望有较大的提高。

　　3.喷墨点样法以定滴供给的方式，通过压电晶体或其他形式从最小的喷嘴内把预先制备好的各种探针点加在片基上不同的位置。其制作的探针点比机械点样法集中和密集，在片基上的附着力也较好，因此可以制作相对较高密度的基因芯片，但喷头的清洗较为困难。

　　4.分子印章法其合成原理与原位合成法相似。根据预先的设计在制作好的有凹凸的微印章上涂上对应的单核苷酸，以印章印刷的方式分配到支持物的特定区域，然后按照顺序逐个依次压印在片基上。在可以自动进行清洗、脱保护、氧化及封闭等化学反应的流体流动池中进行原位DNA合成，直到得到所需的序列的长度。选择适当的合成顺序、设计凹凸位点不同的印章，即可在支持物上原位合成出位置和序列预定的寡核苷酸阵列。分子印章除了可以用于原位合成外，还可以点样方式制作微点阵芯片。