旭月活体研究通讯

通告：今日起，原“imOmics精华速递”改版为“旭月活体研究通讯”，简称“旭月通讯”，每周一期。除介绍最新的NMT文献外，还有实验设计、设备操作、数据分析、文章撰写、审稿答疑......更多干货，等你来撩。

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NISC文献编号：C2015-036

研究使用设备

NMT活体生理检测仪 NMT  Physiolyzer^®

硝酸盐是谷类作物主要的氮源，因此掌握谷物的硝酸盐信号转导对于提高其氮利用效率至关重要。尽管已经在拟南芥中鉴定出了几个硝酸盐信号转导的调节因子，但在谷物中并未发现。

中国科学院遗传与发育生物学研究所童依平课题组在Plant Physiology上发表了一篇文章，题为“The Nitrate-Inducible NAC Transcription Factor TaNAC2-5A ControlsNitrate Response and Increases Wheat Yield”，主要探究谷物中硝酸盐转运反应。

野生型与过表达型玉米，在高低氮条件下根部NO₃^-流检测。正值表示吸收。

课题组从小麦中分离到一种硝基诱导的谷类特异NAM，ATAF和CUC(NAC)转录因子TaNAC2-5A。染色质免疫沉淀试验表明：TaNAC2-5A可直接与硝酸盐转运蛋白和谷氨酰胺合成酶编码基因的启动子区域结合。小麦中TaNAC2-5A过表达促进根的生长以及硝酸盐吸收速率，从而提高根系吸收氮素的能力。

研究利用基于非损伤微测技术（Non-invasive Micro-testTechnology, NMT）的NMT活体生理检测仪 Physiolyzer®，检测根部NO₃^-流，发现转基因型植物根部的NO₃^-吸收速率显著高于野生型，这为TaNAC2-5A促进作物根部NO₃^-吸收提供了最直接的生理证据。

2018年6月4日，旭月研究院前往中科院遗传所开展了非损伤微测技术应用培训。现场的老师同学，就非损伤检测植物钾营养吸收，提出了具有代表性的几个问题。

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一、为什么测不到钾营养吸收

1. 饥饿处理

·氮（N）、钾（K）等营养吸收实验的首要关注点。N饥饿、K饥饿的时间，参考文献，一般为2-7天（C2014-022，想要文献全文，请在底部留言您的邮箱及文献编号）。

·有的老师可能不愿接受饥饿处理，认为对其实验来说，又多了一个胁迫因素“饥饿胁迫”。当然，从严谨的角度出发，在可以接受的工作量前提下，您可以同时设置饥饿、非饥饿组，都进行尝试。

我要说的是，在NMT没有出现前，植物对N、K吸收的证据，主要来自于N、K含量的测定，例如ICP-MS或同位素质谱，这些检测手段都不是实时检测，而属于“终点法”，即检测一个“起点”值，再检测一个“终点”值，二者之差，即为植物对N、K吸收的量。但事实上，NMT出现后，检测发现，营养元素并非每时每刻都处于吸收的状态（NMT是实时监测），而且对植物根来说，也并不是每个部位都会吸收（NMT是微米级精确定点检测）。受传统技术影响，需要给广大的研究者一定的时间空间，接受这些新的结果。NMT发现植物对N、K的实时吸收信号很微弱，所以需要通过通过“饥饿”等手段，来放大这一过程，以便观察各组间的信号差异。

2. 苗龄

·离子流的变化，在植物生理上属于早期事件，也就是样品在宏观上还没有差异的时候，离子流已经开始发生变化。反之，宏观上已经可以察觉到变化时，离子流的差异可能无法检测到了。所以常规的实验时间点，与离子流的时间点，会有时间差，一般离子流检测相比于常规实验时间点，都要靠前。

·根据经验，拟南芥（C2011-003）、水稻（C2014-022）、小麦、番茄等草本植物，大小一般都是3周内。如果太大，例如超过一个月，离子流信号可能就很弱了。

·特别要注意，有的老师会告诉我，用其它方法（ICP-MS）检测发现，苗大小为30天时，可以看到钾含量差异，或者直接告诉我希望同前期的其它实验条件保持一致（其它实验都有用30天的苗）。您可以去尝试，但是我为什么不建议您用太大的苗，原因参考上文。

3.检测液浓度

据经验，在很多情况下，高K环境会抑制根对K的吸收。所以检测液中的K浓度，一般设置为0.1 mM~0.5 mM。但是有些实验要求在不同的K浓度下检测，则可自行设置。

4.检测位点

在“饥饿处理”中，我们已经提到，植物根部并非每个部位都会吸收K，参考文献发现，有的是距离根尖100 μm处的分生区，有明显K吸收（C2011-003）；还的是距离根尖1.4 cm处的成熟区（C2014-024）。所以您在实验的最开始，需要通过对自己样品根部各区域进行扫描检测（简称“扫根”），最终确定K吸收信号最明显的位点，继而定点检测。

杨树根部NH₄⁺、NO₃^-扫根结果（C2014-025）

二、检测K⁺时信号波动大

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1. 检测前让样品在检测液中“待”一会

解决方案：实验的前几个样品多测一会，摸索稳定所需时间（平衡阶段）。

样品从培养液中，进入到检测液里，也需要适应。所以让样品在检测液中“待”一会，可能是5分钟或10分钟，然后再上样检测。这样，就可以排除前期环境变化导致的信号波动的影响了。具体原因可观看视频《NMT实验设计及作图培训》。

点击查看视频

2. 波动信号可能是重要发现

请参考现代非损伤微测技术联合创始人许越的博文《飘忽不定的诺贝尔奖机遇：如何理解和用好NMT数据？》

这是一位老师和旭月工程师在检测间隙，一起出去吃午饭时，无意中记录下的数据。看出有什么规律吗（黄线部分是他们吃饭前记录到的）？

三、审稿人质疑K⁺传感器测到的到底是不是K⁺

现代非损伤微测技术联合创始人许越，教您如何应对审稿人的质疑《如何确定NMT测到的就是K⁺流|审稿人疑问解答》

截止2018年5月份，国内学者发表的NMT相关SCI文章共216篇，总影响因子为846.033。

注：SIET、MIFE、SVET、SPET等技术名称，已经统一为Non-invasive Micro-test Technology，中文名“非损伤微测技术”，简称NMT。