一、目的
本实验的目的是学会cDNA芯片的使用方法。了解各种基因芯片的基本原理和优缺点。
基因芯片这一技术方法在1991年的Science杂志上被首次提出，其高通量、并行检测的特点适应了分析人类基因组计划所提供的海量的基因序列信息的需要，可以说，人类基因组计划是基因芯片技术发展的原因，而对深人研究基因突变和基因表达的有效方法的需求又是促进基因芯片技术发展的动力。
由于基因芯片高速度、高通量、集约化和低成本的特点，基诞生以来就受到科学界的广泛关注，正如晶体管电路向集成电路发展的经历一样，分子生物学技术的集成化正在使生命科学的研究和应用发生一场革命。
根据固定在芯片载体上的核酸分子的不同，基因芯片可以分为cDNA芯片和寡核昔酸芯片等。寡核昔酸芯片主要基于光引导聚合技术，该技术是Affymetrix公司开发的专利技术，由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。
二、原理
基因芯片(Gene Chip,DNA Chip)，又称DNA微阵列(DNA
Micorarray)，是指按照预定位置固定在固相载体上很小面积内的千万个核酸分子所组成的微点阵阵列。在一定条件下，载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记，在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号。
基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测和结果分析。
1、芯片制备-目前制备芯片主要以玻璃片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA作为探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术。以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
2、样品制备-生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。所以，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的蛋白质或DNA、RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。
3、杂交反应-杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行的反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减少生物分子之间的错配率。
4、信号检测和结果分析-杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强弱经过芯片扫描仪和相关软件可以分析图像，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。
目前，基因芯片主要由寡核苷酸芯片和cDNA芯片两大类组成。以下分别介绍这两类芯片的基本原理和特点：
寡核苷酸芯片(Oligonucleotides Chip)
概念：是指做在固相载体上的寡核苷酸微阵列。其制备方法以直接在基片上进行原位合成为主、有时也可以预先合成，再按照制备cDNA芯片的方法固定在基片上。原位合成(In
situ
synthesis)是目前制造高密度寡核苷酸芯片最为成功的方法，有几种不同的工艺，其中最著名的是美国Affymetrix公司(http://www.affymetrix.com)的专利技术——光引导化学合成法(Light-directed
chemical synthesis process)。产品名为GeneChip。
Affymetrix公司已公开的光引导化学合成主要过程如下：首先根据杂交目的确定寡核昔酸探针的长度和序列。再由计算机设计出合成寡核苷酸时用到的所有光掩膜(Masks)。最后做探针合成。光导原位合成技术的优点是可以用很少的步骤合成极其大量的探针阵列，探针阵列密度可高达到每平方厘米一百万个。而这种方法的主要缺点：一是需要预先设计、制造一系列掩模，造价较高：二是每步产宰较低.因此合成探针的长度受到了限制。
此外，原值合成的方法还有Incyte Phamaceuticals5公司(http//www.incyte.com)和Rosetta
Biosystem Inc公司等使用的基于喷墨打印原理的原价合成法(IN situ synthesis with reagents delivered by
ink-jet printer
devices)。喷印装置与普通的彩色喷墨打印机类似，用四种碱基液体取代墨盒中的彩色墨汁，通过计算机控制喷印机将特定种类的试剂喷洒到预定的区域上。冲洗、去保护、偶联等过程与传统的DNA固相原值合成技术相同。喷印法可以合成长度为40~50
nt的寡核昔酸链，每步产率可以达到99%，合成30nt的寡核昔酸产率可达70%以上。日本佳能公司利用其独创的“气泡喷墨”技术，仅用24
pl溶液就可以在基片上制作出近百微米的小探针点.每平方厘米可排布近20000个探针，克服了喷墨打印技术制备探针阵列密度较小的缺点。
寡核昔酸芯片的杂交和检测分析：样品处理和杂交检测方法与cDNA芯片是一致的。由于寡核昔酸阵列多需要区分单碱基突变.因此严格控制杂交液盐离子浓度、杂交温度和冲洗时间是杂交实验成败的关键。
cDNA芯片(cDNA Chip)
概念：在玻璃片、硅片、聚丙烯膜、硝酸纤维素膜、尼龙膜等固相载体上固定的成千上万个cDNA分子组成cD4A微阵列。制作cDNA芯片最常用的固相载体是显微镜载玻片，载玻片在使用前需要进行表面处理，目的是抑制玻璃片表面对核酸分子的非特异性吸附作用。常用的表面处理方法有氨基化法、醛基化法和多聚赖氨酸包被法。
cDNA芯片的制备：制备cDNA芯片多用合成后点样法(Spotting after
synthesis)，简称点样法。合成后点样法使用的专用设备称为点样仪(Arrayer)，目前有多家国外公司(如
Bopdiscovery,Biorobotics,Vartesian Technologies,Genetic
Microsystems,Genomicssolutions等)生产点样仪。点样仪的主要部件是由计算机系统控制的电脑机械手。点样时电脑机械手利用点样针头(Pin)从96或384檄孔板上蘸取cDNA样品，按照设计好的位置点在载玻片表面。针头的数目、机械手的移动时间、针头清洗和干燥时间、样品总数和载破片数目共同决定了点样所需时间;针头的直径和形状、样品溶液的粘滞程度以及固相载体的表面特性决定了芯片上液滴的量和扩散面积。
除点样法以外，cDNA芯片也可以用电子定位法(Electronic
addressing)制备。美国Nanogen公司(http://www.nanogen.com)
最早使用这项技术，他们对空白片上的持定位点进行电活化，使相应活化点的表面带有电荷，成为“微电极”，能够吸附cDNA分子。带有微电极的片子与样品溶液共同孵育，溶液中的cDNA分子被吸附的微电极上，并与片子表面发生化学结合从而固定。用这种工艺制备的芯片的优点是：微电极的电吸附作用可以提高与靶核酸的杂交效率。缺点是制备复杂.成本较高。这种带有微电极的芯片也称为主动式芯片。许多公司出售商品化的cDNA芯片，可以根据需要从公司定制。美国
Incyte公司是显著名的cDNA芯片提供商之—，其产名为GEMTM芯片，每张片子上最多可以含有10000点，对样品中mRNA的检出限达到
2pg，对两种来源样品中的基因差异表达的检出限为2倍。
