天然和人工培育冬虫夏草的比较蛋白质组学表征及其营养价值评估

　　冬虫夏草因其营养和药用价值而受到越来越多的关注。近期，有报道称，成功通过人工方式培育出冬虫夏草。本文主要使用非标定量Label-free蛋白质组学技术研究自然生长和人工培育的冬虫夏草之间的蛋白质组学差异，揭示冬虫夏草蛋白质组学特征，了解其发育感染过程，并为人工培育提供参考信息。

　　人工培育的虫草和青藏高原上自然生长的虫草在形态特征高度相似（图1），并各自选择3个批次的样本进行蛋白提取。将虫草分为虫体和子座，分别用SDS-PAGE对样本蛋白进行质控检测（图2）。

对解析的蛋白质组学数据进行质控分析，肽段质量容差为0.1Da，说明质谱鉴定肽段准确度高，肽段长度范围为8-38个氨基酸，分子量范围为400-12000Da，与预设分子量范围一致。在本次实验中，大多数鉴定蛋白含有2-20个unique肽段。

　　使用变异系数（CV）验证实验方法的重复性，在本次实验结果中，人工培育的虫体（AC）、子座（AS）、天然生长的虫体（NC）、子座（NS）的CV值中位数分别为31.88%，27.44%，34.49%，34.94%。12个样品的相关性系数在0.68-0.93之间，这些结果证明了实验的可重复性。在所有的鉴定蛋白中，基于强度的绝对定量（iBAQ）值分布在1200中最丰富的蛋白质中（图3A）。所有样品和组内蛋白质的平均iBAQ值相似（图3B）。这些结果表明蛋白质组内比较可能不受蛋白质丰度系统差异的影响。

在本次实验中，12个样品共鉴定到22829条可信肽段（conf ≥ 95%），2541个蛋白质。使用PCA分析天然虫草和人工培育虫草蛋白表达图谱特征，发现虽然虫体和子座蛋白质分布有明显区别，但是天然虫草和人工培育虫草的整体蛋白质分布类似（图4）。COG功能注释到了1951个蛋白质。这些蛋白质主要参与能量产生、转化，氨基酸转运、代谢和转录调节（图5）。

图5  COG功能注释结果

　　本次实验中，显著差异蛋白数目分别为107（NC/AC）、58（NS/AS），195（AC/AS）、168（NC/NS）。使用层次聚类分析蛋白质表达变化趋势，主要聚成三类，Cluster I 由在AS中增加并在NC中减少的蛋白质组成；Cluster II包括在AC中降低并在NS中增加的蛋白质；Cluster III包括在AC或NC中增加并在AS和NS中均降低的蛋白质（图6）。为了确定这些蛋白质的功能特性，将它们的序列映射到GO数据库。GO富集表明这些差异丰富的蛋白质主要参与生物调节、单一生物过程，结合、催化活性，并定位于细胞器、细胞膜。结果说明这些显著差异蛋白在虫草生命活动中主要发挥催化和结合作用（图7）。

　　为了进一步研探索发生变化的生物学途径，使用KEGG Pathway 数据库进行富集分析，结果表明，天然虫草和人工培育虫草之间的差异蛋白主要参与次生代谢物合成、丙酮酸代谢、赖氨酸生物合成。在氨基酸合成、代谢途径中（图8），有7种相关蛋白发生表达量变化，其中，核糖5-磷酸异构酶（K01807）和丙酮酸激酶（K00873）在NC中降低，而NADH（P）结合蛋白（K00831）在NC中增加； NS中糖基转移酶（K00766）和雄性不育蛋白（K00143）增加；异柠檬酸/异丙基苹果酸脱氢酶（K00052）在NC中降低但在NS中升高，精氨酸琥珀酸合成酶（K01940）在NC和NS中均下降。

　　为了验证组学结果，LC-MS分析虫草代谢产物。根据代谢组学结果，共鉴定出8种氨基酸，其中4种氨基酸含量发生显著改变，具体为赖氨酸，精氨酸，苏氨酸和丝氨酸（图9）。氨基酸的变化趋势跟上游合成它们的酶的变化趋势是一直的。根据中国药典中关于测定核苷和核苷酸含量，特别是腺苷的规定，NC/NS以及AC/AS总离子色谱图中没有观察到显著差异（图10）。

　　虫草蛋白质中必须氨基酸比例与人类蛋白质中的比例相似，说明它具有营养价值。而且，天然虫草和人工培育虫草蛋白质中氨基酸成分和含量几乎相同，没有显著差异。

　　该研究提供了天然虫草和人工培育虫草的蛋白表达图谱，发现天然虫草和人工培育虫草的真菌中的蛋白质和代谢产物组成相似，而虫体和子座的蛋白质和代谢产物方面则有区别。蛋白质组学结果表明氨基酸合成和代谢途径受到栽培方式的影响。 这些蛋白质组学数据将有助于理解冬虫夏草的药用价值，并为其人工培育提供参考。

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