兽药残留分析方法详解

　　内容摘要：免疫分析技术(IAs)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，小分子量的兽药(Mw<25()())一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应。将兽药小分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体(一般为蛋白质)以共价键相偶联制备成人工抗原，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该兽药具特异性的活性物质(免疫球蛋白或称抗体)来识别该兽药分子并与之结合。这样的结合反应不仅可在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。

　　气相色谱法、液相色谱法等与质谱的联用技术是兽药残留分析常用的定量及确证方法，具有高度选择性和可靠性，在代谢物结构和代谢途径及其药理学与毒理学作用的分子基础研究中具有非常广阔的前景。现在就一些农业兽药残留的检测方法做简要的介绍。

　　1.免疫分析技术

　　免疫分析技术(IAs)是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术，小分子量的兽药(Mw<25()())一般不具备免疫原性，不能刺激动物产生免疫反应。将兽药小分子以半抗原的形式通过一定碳链长度的连接分子与分子量大的载体(一般为蛋白质)以共价键相偶联制备成人工抗原，使动物的免疫系统发生应答反应，产生对该兽药具特异性的活性物质(免疫球蛋白或称抗体)来识别该兽药分子并与之结合。这样的结合反应不仅可在体内进行，也可在体外进行，符合质量作用定律，这就是免疫分析的基础。一旦制备出特异性抗体，IAs有许多模式供选择，灵活多样，新的分析手段和应用不断出现，这是几十年来对IAs的研究经久不衰的重要原因。按照标记物或检测体系来划分，IAs可分为放射免疫测定法(RIA)、酶免疫测定法(EIA)、荧光免疫测定法(FIA)、化学发光免疫测定法(C1A)、固相免疫传感器等;按反应介质分为均相或非均相免疫测定法。与常规理化分析技术相比，免疫分析具有特异性强、灵敏度高(检测限可达1弘g～1pg)、方便快捷、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。

　　样本前处理步骤最能体现IAs的优越性。常规的理化测定技术，如高效液相色谱(HPLC)或Gc，通常需要烦琐的样本前处理操作(样本提取、净化、浓缩和衍生化)，前处理至少占用70%以上的分析工作量。IAs有很高的选择性，前处理要求简单，一般仅需提取就足够了，少数情况如高脂肪样本需一定净化步骤;IAs有很高灵敏性，可使用稀释样本或提取液的方式消除基质的干扰，能进一步简化操作，如动物组织中氯霉素、磺胺二甲基嘧啶和阿维菌素残留的测定。IAs取样量少、前处理简单、仪器化程度低，分析效率约为HPI。c或Gc的几十倍;IAs不存在HPLC或Gc对待测物蒸气压、热稳定性、卤素、发色团等理化性质的限制，特别适用于难气化或难分离的高极性/离子型兽药或大分子化合物的分析。IAs已在大批量样本中某些兽药残留的快速筛选性检测和常规分析技术测定困难的兽药的分析中占据主流地位。以下就一些免疫分析技术方法做简要的介绍。

　　(1)酶免疫测定法(EIA) 酶免疫测定法是20世纪70年代发展起来的非同位素IAs，其使用酶进行标记，避免了同位素标记的放射性污染和标记物的稳定性问题，操作方便，仪器简单。在兽药残留快速分析中应用最广泛的是酶联免疫吸附测定法(ELISA)，目前望尔生物公司等食品药残检测技术研究单位已有近二十多种用于兽药残留检测的商品化ELISA试剂盒。ELISA检测方法属于非均相免疫分析技术，一般将抗原或抗体吸附于固相载体(包被抗原或抗体)，加入酶标记，抗原或抗体以及待测物，进行竞争性免疫反应，反应达平衡后，倾去反应液，洗涤酶标板，即从非标记物中物理分离结合的标记物，再加入酶的底物，进行酶促反应约30min，经酸固定停止显色反应后，再分光光度法进行检测。由于近年来各专业性公司在包被抗原、特异性抗体(尤其是单克隆抗体)、酶、显色系统制备方面，以及在ELISA反应条件、缓冲液系统的研究方面取得了突破性进展，使商业化ELISA试剂盒无论在灵敏度、稳定性、精密度方面均达到了兽药残留检测的要求，加上其操作简便、仪器化程度低和成本适中等优点，ELISA试剂盒已成为目前国内外兽药残留检测的主流技术。

　　(2)荧光免疫测定法(FIA) 荧光免疫测定法(FIA)为仅次于EIA的非同位素IAs，使用普通光激发荧光物质的FIA，由于易受背景干扰等原因，限制了FIA的灵敏度。近年来发展起来的荧光偏振免疫测定法(FPIA)、荧光淬灭免疫测定法(FQIA)和时间分辨荧光免疫测定法(TrFIA)，大大提高了FIA的灵敏度(可达10_1’～10一加mol/L)。使得FIA在环境监测、医学和药物残留方面的应用得到进一步发展。

　　(3)荧光偏振免疫测定法(FPIA) 荧光偏振免疫测定法(FPIA)是一种使用荧光物质作为标记物的免疫测定法，使用普通光激发荧光物质后得到的都是普通荧光，当使用偏振光作为激发光时，视分子的运动状态，发射的荧光可能是振动方向随机化的普通荧光，或是只在某一平面振动的偏振荧光。在反应液中，游离的标记药物分子体积小，在布朗运动中转动速度快，受偏振光照射后产生荧光的偏振方向被分散(随机化)，不能形成偏振光，只发射普通荧光;与抗体结合的标记药物分子体积大，布朗运动速度缓慢，甚至不能转动而形成定向排列，所以受偏振光激发后能产生偏振荧光。该方法灵敏度高，抗背景干扰性强，适用于复杂基质中痕量组分的分析。

　　(4)胶体金免疫测定法胶体金免疫测定法是在免疫渗滤的基础上建立的一种简单快速的免疫学检测技术，它往往以条状纤维层析材料为固相(通称试纸条)，通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动，并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体(如抗体或抗原)发生高特异、高亲和性的免疫反应，层析过程中免疫复合物被富集或截流在层析材料的一定区域(检测带)，通过酶反应或直接运用可目测的标记物(如胶体金)而得到直观的实验现象(如显色)。而游离标记物则越过检测带，达到与结合标记物自动分离之目的。1971年，Faulk和Taylor首次用胶体金标记技术研究沙门氏菌细胞抗原成分，将胶体金与抗原结合，应用于电镜水平的免疫细胞化学研究。随后胶体金技术不断发展，出现了标记抗球蛋白抗体的间接免疫金染色法，并开始应用于各种药物残留和环境分析中。这种方法灵敏度较高，操作简便快速，分析结果易于判定，特别适用于残留监控中现场的快速筛选性监测分析。

　　(5)免疫传感器 免疫传感器是生物传感器的一种，传感器的生物敏感层与复杂样品中特定的目标分析物之间通过抗体与抗原之间的识别反应，产生一些物理化学信号(如光、热、声、质量、颜色、电化学等)的变化，这些变化通过不同原理的传感器(如光敏管、压电装置、光极、热敏电阻、离子选择性电极等)转换成第二信号(通常为电信号)，经放大后显示或记录。利用兽药与特异性抗体结合反应特性研制出的免疫传感器，可用于对相应兽药残留进行快速定量定性检测。免疫传感器的最大特点是便携性，免疫传感器高度的自动化、微型化与集成化减少了对使用者及环境技术条件的依赖，测定速度快，适合现场或野外进行快速筛选检测。