硒蛋白P的高效表达研究

硒是一种对人体健康有着重大意义的微量元素，与癌症、神经方面的疾病等密切相关，它大多以硒代半胱氨酸sec的形式存在于硒蛋白中。RPL30、SBP2、Efsec等对硒蛋白的表达具有重要作用，为了研究硒蛋白P的生物合成机制，需要构建反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳动物表达载体。

哺乳动物细胞表达外源重组蛋白可利用质粒转染和病毒载体的感染，利用质粒转染获得稳定的转染细胞需几周甚至几个月时间，而利用病毒表达系统则可快速感染细胞，在几天内使外源基因整合到病毒载体中，尤其适用于从大量表达产物中检测出目的蛋白。哺乳动物表达载体必须包含原核序列、启动子、增强子、选择标记基因、终止子和多聚核苷酸信号等控制元件。美迪西生物医药所提供的哺乳动物蛋白表达系统基于无血清培养体系，提供基因表达优化、瞬时表达、稳定表达及抗体生产等多种真核蛋白服务项目。

RPL30是核糖体大亚基60S的组成部分,由RPL30基因所编码,主要存在于真核生物中.根据已报道的部分哺乳动物核糖体蛋白L30亚基基因(RPL30)的相关信息设计引物，运用反转录PCR（RT-PCR）技术，以大熊猫(Ailuropoda melanoleuca)的肌肉组织为材料，成功地克隆了核糖体蛋白L30亚基RPL30基因,并对其进行了测序及初步分析。

SBP2是硒蛋白结合蛋白，是硒代半胱氨酸合成的限制因子。SBP2蛋白因子上有与硒蛋白的mRNA结合的区域，在生物体外和体内的实验均发现SBP2与mRNA结合在一起。有研究表明SBP2在经过一定折叠后，可以与EFsec相互作用，帮助其发挥促进延伸的作用。同时SBP2可能具有避免翻译在UGA处终止的作用，在硒蛋白合成时，延长因子EFSec需要与SBP2共同作用。EFSec与特定的t-RNA形成复合物，作用于UGA密码子使其表达硒代半胱氨酸。研究表明在细菌中，通过SELB因子上的EFSec和secis-RNA连接位点，可以把EFSec和secis都带到核糖体上。EFSec需要与SBP2一起发挥作用。

克隆RPL30、SBP2和EFsec三个反式作用因子基因，并构建其哺乳动物表达载体，然后与重组质粒pcDNA3.1-iGFP-Sepp1共转染HEK293细胞，研究三个反式作用因子对硒蛋白P基因表达的影响。为实现硒蛋白P在哺乳动物细胞中高效表达奠定基础。

方法是应用RT-PCR方法从人乳腺癌MCF-7细胞中扩增RPL30基因，利用双酶切法将其连入真核表达载体pcDNA3.1（+）；采用半合成-酶连法将EFsec基因中所缺失的片段补齐，用PCR方法扩增拼接产物，将其克隆到真核表达载体pcDNA3.1（-）；真核表达载体pCMV-XL4-SBP2购自OriGene生物公司；将三个反式作用因子表达质粒与硒蛋白P表达质粒按照不同的组合方式，采用脂质体转染法瞬时转染HEK293细胞；采用RT-PCR法检测三个反式作用因子的表达及其对硒蛋白P基因转录水平的影响。

该研究成功克隆了RPL30基因并构建其表达载体pcDNA3.1-RPL30，准确地将EFsec-基因补齐了其5′端缺失的基因序列，并成功地构建了表达载体pcDNA3.1-EFsec；RT-PCR方法联合条带平均密度值分析证实，转染组与正常组相比，目的基因RPL30、SBP2和EFsec的mRNA水平显著增高，表明转染成功并有效表达。

因此反式作用因子RPL30、SBP2和EFsec基因哺乳动物表达载体的成功构建以及其超表达后对硒蛋白P基因转录水平的作用分析，为深入研究硒蛋白P的生物合成机制打下了基础。