白细胞介素8蛋白表达纯化及其与肿瘤的关系

白细胞介素是一类分子结构和生物学功能已基本明确，并具备调节作用的细胞因子。按照其发现顺序给予序号，目前已经命名38种（IL-1～IL-38）。IL-8属于其中一组小的分泌型炎症性细胞因子，IL-8蛋白表达纯化可为其进一步的理论研究和大批量生产奠定基础。研究发现IL-8 不仅可以促进肿瘤细胞转移，更是预示癌症患者不良预后的细胞因子，靶向 IL-8 信号通路的药物有望成为防治肿瘤转移的抗癌新药。

1、白细胞介素8蛋白表达纯化与活性检测

白细胞介素—8 (Interleukin-8, IL-8)是一种多功能性的细胞因子，属于趋化因子CXC亚家族的一员，是体内炎症反应应答的主要介质之一。除常规生化检测方法之外，可利用基因工程技术实现重组人源性IL-8蛋白表达纯化，并利用PCA技术实现重组IL-8活性检测。美迪西生物医药是一家医药研发外包公司，在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，其拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）哺乳动物细胞蛋白表达系统。

将3种不同亚型的重组人IL-8基因片段分别与表达载体pME-15-6His和pET-32a连接，转入哺乳动物细胞HEK 293F和大肠杆菌BL2l(DE3)，进行IL-8的表达。采用IMAC亲和层析柱对重组人IL-8进行纯化。根据PCA技术，构建了Split-TEV GPCR激活检测系统，对纯化的目的蛋白进行了细胞内生物学活性检测。结果成功构建了真核表达载体pME-15-6His/IL-8formI，前体IL-8基因在HEK293F中正确分泌表达，其N端信号肽(残基1-20)被切除，经过纯化得到的重组蛋白为成熟的IL-8 form. I(残基21-99)；成功构建了原核表达载体pET-32a/IL-8 formII和pET-32a/IL-8 form. III，N端融合了Trx标签的重组蛋白在大肠杆菌中正确表达，经过纯化和重组肠激酶酶切得到的重组蛋白为IL-8 form. II(残基23-99)和IL-8form. III(残基28-99)。纯化后的重组人IL-8对其天然受体IL8RB具有明显的激活活性，其ECso值分别为：12.32ng/ml (Form. Ⅰ)、15.14 ng/ml (Form. Ⅱ)和2.85ng/ml (Form. Ⅲ)。

成功构建、表达和纯化了具有生物学活性的3种不同亚型的重组人IL-8，为进一步的理论研究和大批量生产奠定了基础。研究表明IL-8在调节细胞生长与分化、炎性反应、免疫应答、机体防御损伤及修复等过程中起着重要作用，也有研究发现，IL-8在肿瘤发生发展中也发挥重要作用。

2、白细胞介素8与肿瘤的关系

（1）白细胞介素8的表达与肿瘤的关系

趋化因子IL-8的表达可分为组成型和诱导型。研究发现，IL-8的组成型表达与多种肿瘤的发生发展密切相关。通过实验发现晚期结肠癌患者血清IL-8表达水平较健康对照高10倍，IL-8高表达不仅与肿瘤临床分期相关联，而且与化疗初不良反应、肠壁浸润及肝脏转移亦相关联。

（2）白细胞介素8与肿瘤易感性的关系

易感性指在相同环境下，由遗传基础所主导的不同个体患病的风险。随着对肿瘤研究的不断深入，易感性的研究在肿瘤中占据越来越重要位置，并成为研究的一个重要课题。作为肿瘤微调节器，IL-8不仅表现为肿瘤中表达水平的变化，而且与肿瘤如胃癌、食管癌、肺癌、口腔癌等易感性相关联。研究结果表明IL-8-251A/T单核苷酸多态性与肿瘤的易感性相关，为深入探究IL-8与肿瘤的关系做好铺垫，为肿瘤的治疗提供新的途径。

（3）IL-8与肿瘤血管生长的关系

肿瘤生长的血管依赖性理论指的是肿瘤的发展演进除与其自身细胞增殖有关外，更需要其周围血管提供丰富的营养支持。这一里程碑理论的提出为肿瘤的研究开拓了一个新的研究领域，通过阻断血管的生成，就有可能抑制肿瘤细胞生长，进而抑制肿瘤的侵袭、转移和复发。经过几十年的探索，发现多种细胞因子均与血管生成密切相关，如VEGF家族、表皮生成因子（EGF）、血管生成素家族、FGF家族、转化生长因子以及趋化因子家族等，其中趋化因子IL-8是近年来研究的热点。研究者发现IL-8能以自分泌和旁分泌形式上调IL-8、胶原酶Ⅳ、VEGF、EGFR和下调E-钙黏蛋白在肿瘤细胞内的表达以及增加MMP-9的活性和侵袭力直接或间接调控肿瘤血管的生长。还有研究者发先IL-8还可通过抑制内皮细胞的自发性凋亡而调节肿瘤血管的生长，进一步证实IL-8与肿瘤血管生长的密切关系。

（4）IL-8与肿瘤演进的关系

肿瘤演进指肿瘤恶性程度逐步增高的过程，包括生长速度加快、浸润周围组织并发生远处转移。上皮间质转化（EMT）是癌细胞侵袭和转移的细胞学基础，而E-cadherin、β-catenin的变化是EMT的特征性标志，研究者应用免疫组化的方法，对肝细胞肝癌患者石蜡组织切片标本中IL-8、β-catenin、E-cadherin、MMP-9等指标进行检测，结果显示，IL-8与β-catenin、MMP-9的表达呈正相关，与E-cadherin的表达呈负相关。IL-8高表达标本中β-catenin、 MMP-9的表达相应增加，E-cadherin的表达则出现降低。

（5）IL-8与肿瘤耐药性的关系

    随着化疗药物的广泛使用，肿瘤的耐药问题日益突出。最近的研究发现耐药的多种肿瘤（如肺癌、胃癌、乳腺癌、膀胱癌等）中IL-8的表达水平均有不同程度升高。研究者以四种上皮性卵巢癌细胞为实验对象，多途径研究IL-8与卵巢癌细胞的耐药性。结果发现，卵巢癌细胞的耐药性与IL-8对耐药相关基因（MDR1、MRP、LRP、GST-P、Topo-N）以及凋亡相关基因（Bc-l2、Bc-lxL、Mc-l1、XIAP）的调控有关，进行深入研究发现该调控作用具有剂量依赖性。IL-8表达水平高的卵巢癌细胞，耐药相关基因以及凋亡相关基因的表达也相应增高，使化疗药物产生的凋亡信号成为无效信号，细胞凋亡减少，最终导致卵巢癌细胞对顺铂和紫杉醇的敏感性降低。

　IL-8在恶性肿瘤中的高表达与肿瘤的发生发展关系密切，不仅影响肿瘤血管的生成，而且能促进肿瘤细胞的侵袭和转移到周围淋巴结以及转移到周围组织肝和肺等。通过血清、血浆、细胞上清液以及组织匀浆中IL-8的检测，可能为恶性肿瘤的早期诊断提供帮助。干扰或下调IL-8的表达，阻碍其功能的发挥，进而抑制肿瘤发展演进、延缓病程进展，以期为恶性肿瘤的靶向治疗提供新的思路。