质谱基质介绍
上一篇 / 下一篇 2008-10-24 14:03:08/ 个人分类：质谱
MALDI_TOF Sample and matrix preparation method
Sample and matrix preparation method
1. Choose the appropriate matrix depending on the MW or the protein:
2. Make a fresh saturated matrix solution in the appropriate solvent
• Alpha-cyano: 50% acetonitrile, 0.1% TFA in deionized water
• Sinapinic acid: 30-50% acetonitrile, 0.1% TFA in deionized water
• DHB: 10 mg/ml in water, 50% CAN or other appropriate solvent for analyte
• 3-HPA: prepare saturated solution of 3-HPA in Milli-Q water (~50g/L) and 50g/L solution of diammonium citrate. Combine 3-HPA:NH4citrate 9:1
• Super DHB: DHB+ 10% 5-methoxysalicylic acid, Preparation: Solution A= 10 g/L DHB in 20% CAN, Solution B=10g/L 5-methoxysalicylic acid in 50% CAN, Combine A:B ( 9:1)
Prepare CHCA matrix:
a. Add the solvent into the matrix
b. Vortex for 1 min.
c. Centrifuge for 20 seconds to remove any undissolved matrix from the solution. Alternatively, allow the solution to sit for 5 minutes until undissolved matrix settles, then the top clean matrix can be used.
3. choose a plate
4. prepare samples (~ 20 µM, so that final concentration can be ~10 µM after 1:1 dilution with the matrix); for good results sample needs to be clean:
a. no interference: TFA, formic acid, b-ME, DTT, organic solvents, HCL, acetic acid, ammonium hydroxide
b. tolerable (< 50 mM): HEPES, MOPS, TRIS, ammonium acetate
c. avoid: glycerol, sodium azide, DMSO, SDS, phosphate, NaCl, 2 M urea, 2 M guanidine
d. if protein stock is concentrated, dilution in water would be fine
e. for less concentrated samples, use Zip tip treatment
f. Zip tip treatment:
• condition Zip tip with 10 µl CAN, 10 µl 50% CAN/0.1%TFA, then 2X 10 µl 0.2% TFA
• load sample by pipetting 5-10 µl up and down several times
• wash tip 3x with 10 µl 0.1% TFA to remove salts
• elute with 3-5 µl of 30-50% CAN or matrix solution
5. Mix sample and matrix solutions 1: 2 in the tube. If using internal standards premix those in the sample solution before combining with the matrix. If mixing on the sample plate, make sure to put the sample first, otherwise, the matrix might dry before the mixing occurs.
6. Load 0.5-1.0 µl of premixed matrix, allow the mixture to air dry until all solvent is evaporated, usually less than 5 minutes. Analyze within one day for best results.
Keep the sample plate in good condition:
a. During the acquisition, there is 20000 voltage on the sample plate. If your data is not good, perhaps the sample plate is too old;
b. No big scratch on the surface of the plate; the pin at the back is not broken;
c. Put it in a safe place and do not drop it;
Clean sample plate:
a. rinse the plate with a squeeze bottle of solvent;
b. rub with a lint-free lab tissue to clean;
c. rinse with deionized water;
d. examine the plate. If you see any sample or matrix residue, oil, or fingerprints on the plate, soap the sample plate in a working solution of laboratory detergent in water for 5-10 minutes. (Do not leave the sample plate in detergent for longer than 10 minutes. Longer exposure can cause the bottom holders on the sample plate to corrode. Do not sonicate sample plates or use acid to clean sample plates. Both can alter the surface of the sample plate, and reduce the quality of the data obtained;
e. If residue remains, wipe the plate with a lint-free tissue or cotton swab. A soft toothbrush works well;
f. Rinse the plate thoroughly in deionized water;
g. Allow the plate to dry in an area where it will not be exposed to contaminants.
1. Choose the appropriate matrix depending on the MW or the protein:
2. Make a fresh saturated matrix solution in the appropriate solvent
• Alpha-cyano: 50% acetonitrile, 0.1% TFA in deionized water
• Sinapinic acid: 30-50% acetonitrile, 0.1% TFA in deionized water
• DHB: 10 mg/ml in water, 50% CAN or other appropriate solvent for analyte
• 3-HPA: prepare saturated solution of 3-HPA in Milli-Q water (~50g/L) and 50g/L solution of diammonium citrate. Combine 3-HPA:NH4citrate 9:1
• Super DHB: DHB+ 10% 5-methoxysalicylic acid, Preparation: Solution A= 10 g/L DHB in 20% CAN, Solution B=10g/L 5-methoxysalicylic acid in 50% CAN, Combine A:B ( 9:1)
Prepare CHCA matrix:
a. Add the solvent into the matrix
b. Vortex for 1 min.
c. Centrifuge for 20 seconds to remove any undissolved matrix from the solution. Alternatively, allow the solution to sit for 5 minutes until undissolved matrix settles, then the top clean matrix can be used.
3. choose a plate
4. prepare samples (~ 20 µM, so that final concentration can be ~10 µM after 1:1 dilution with the matrix); for good results sample needs to be clean:
a. no interference: TFA, formic acid, b-ME, DTT, organic solvents, HCL, acetic acid, ammonium hydroxide
b. tolerable (< 50 mM): HEPES, MOPS, TRIS, ammonium acetate
c. avoid: glycerol, sodium azide, DMSO, SDS, phosphate, NaCl, 2 M urea, 2 M guanidine
d. if protein stock is concentrated, dilution in water would be fine
e. for less concentrated samples, use Zip tip treatment
f. Zip tip treatment:
• condition Zip tip with 10 µl CAN, 10 µl 50% CAN/0.1%TFA, then 2X 10 µl 0.2% TFA
• load sample by pipetting 5-10 µl up and down several times
• wash tip 3x with 10 µl 0.1% TFA to remove salts
• elute with 3-5 µl of 30-50% CAN or matrix solution
5. Mix sample and matrix solutions 1: 2 in the tube. If using internal standards premix those in the sample solution before combining with the matrix. If mixing on the sample plate, make sure to put the sample first, otherwise, the matrix might dry before the mixing occurs.
6. Load 0.5-1.0 µl of premixed matrix, allow the mixture to air dry until all solvent is evaporated, usually less than 5 minutes. Analyze within one day for best results.
Keep the sample plate in good condition:
a. During the acquisition, there is 20000 voltage on the sample plate. If your data is not good, perhaps the sample plate is too old;
b. No big scratch on the surface of the plate; the pin at the back is not broken;
c. Put it in a safe place and do not drop it;
Clean sample plate:
a. rinse the plate with a squeeze bottle of solvent;
b. rub with a lint-free lab tissue to clean;
c. rinse with deionized water;
d. examine the plate. If you see any sample or matrix residue, oil, or fingerprints on the plate, soap the sample plate in a working solution of laboratory detergent in water for 5-10 minutes. (Do not leave the sample plate in detergent for longer than 10 minutes. Longer exposure can cause the bottom holders on the sample plate to corrode. Do not sonicate sample plates or use acid to clean sample plates. Both can alter the surface of the sample plate, and reduce the quality of the data obtained;
e. If residue remains, wipe the plate with a lint-free tissue or cotton swab. A soft toothbrush works well;
f. Rinse the plate thoroughly in deionized water;
g. Allow the plate to dry in an area where it will not be exposed to contaminants.
分离膜蛋白的方法（操作）
1）分离细胞膜蛋白的方法：
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2）分离细胞膜蛋白的方法：
1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3）分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
4）分离组织膜蛋白的方法：
1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。
5）分离组织膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
以下用时加入
10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）
Aprotinin（30ul/ml）
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）
冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。
取上清-20保存。
6）分离细菌膜蛋白的方法：
① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。
② 10000g、20min、4℃离心，去上清。
③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④ 超声波破碎细菌。
⑤ 3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
⑥ 超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。
⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。
⑧ 超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。
⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)
7）来源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。
2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。
4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。
7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析
8）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在4摄氏度下进行）
1.在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。
2.加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。
3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。
4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。
5.上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。
6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min，弃上清。
7.用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。
8.粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。
9）用特殊的去污剂选择性的分离。简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
方案
1、放射性标记受试细胞
2、将标记的细胞放在冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
6、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
9、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
10、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3）buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
10）植物中：高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度离心、2水溶性双水相法、3自由流电泳等方法为主。前两种常用。1的产率较高但纯度不高，2是20世纪80年代发展起来的一种分离高纯度质膜的方法，经多次双水相分配即可得到高纯度质膜，近些年此方法广泛用于植物质膜的纯化。
1 冰上刮下细胞后将细胞溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液A中，于室温与液氮罐中反复冻融2次。
2 5000转4度离心，驱除核及未裂解的细胞。
3 取上清12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液B中。
4 12000转4度离心10分钟取沉淀溶于有蛋白酶抑制剂的缓冲液C中提取后测蛋白浓度,SDS-PAGE电泳，分装后-20度保存备用。
buffer A : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4)
buffer B : 1mMkcl,5mMNacl,3mM Mgcl2,50mM Hepes,1mM DTT,0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf(PH=7.4) 1mM EGTA
buffer C : 0.5ug/ml Leupeptin,20uM pmsf,50mMTris-cl(PH=7.0),
2）分离细胞膜蛋白的方法：
1、细胞放在冰上，去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
2、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
3、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
4、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
5、收集水相留作分析
6、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
7、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
8、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1、2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2、缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3、buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
3）分离细胞膜蛋白的方法：
7M urea
2M thiourea
4%chaps
2.5%sb3-10
1000000个细胞，可用此 buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速低温离心30min。
取上清-20保存。
4）分离组织膜蛋白的方法：
1、取组织，加入10ml Buffer A 于冰上充分匀浆。
2、J6-HC离心机800rpm，4℃离心10min后，所得上清液转入超速离心管。
3、100000g，4℃离心1hr。弃去上清，沉淀用适量的 Buffer B重悬，冰上孵育2hr后分装至EP管， Eppendorf台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
4、收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA,1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B：20mM HEPES（PH 7.5），10%甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EDTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。 冰上预冷。
5）分离组织膜蛋白的方法：
RIPA
1XPBS
1%NP40
0.5去氧胆酸钠
0.1%SDS
以下用时加入
10mg/ml PMSF异丙醇（终浓度10ul/ml）
Aprotinin（30ul/ml）
1000mM Sodium Orthovandate（10ul/ml）
冰冻组织100mg/细胞1000000个，可用RIPA buffer 1ml。 冰浴匀浆。冰上置30分钟。
4度高速离心30min，20000转低温离心最佳。
取上清-20保存。
6）分离细菌膜蛋白的方法：
① 于20ml 营养肉汤中过夜培养细菌，37℃，200rpm。
② 10000g、20min、4℃离心，去上清。
③ 20ml预冷的Tris-Mg缓冲液重悬，同样条件离心，再重悬于预冷的Tris-Mg缓冲液。
④ 超声波破碎细菌。
⑤ 3000g，10min、室温下离心去除未破碎细菌。小心吸取上清（含有胞质成分和细菌外被成分）。
⑥ 超速离心I：100,000g，60min，4℃，去除上清（胞质成分），收集细菌外被成分。
⑦ 用10ml含2％的SLS的Tris-Mg 缓冲液重悬沉淀物，室温温育20-30min。
⑧ 超速离心II：70,000g，60min，室温沉淀收集外膜蛋白，去除上清（含细胞质膜）。重复⑦、⑧两步。
⑨ 充分吸除上清，并根据沉淀体积大小用0.1-0.2 ml的ddH2O重悬沉淀物。根据公式：蛋白浓度(mg/ml)=1.450 D280-0.740 D260测定外膜蛋白浓度，调节蛋白浓度至40ug/ul，该蛋白质样品-70℃贮存。
试剂
① Tris-Mg 缓冲液
10mM Tris-Cl
5mM MgCl2
pH 7.3，4℃保存
② 2%(w/v)十二烷基肌氨酸钠 (SLS)
7）来源于Methods Enzymology (1974)
1.取一定量酶处理的细胞，用匀浆器破碎，操作要温和，使细胞膜保持完整。由于水与膜的疏水部分之间有反应，因此要精确掌握分离介质中的离心强度和渗透压，以每克细胞湿重加40ml介质。
2．用Potter-Elvehiem匀浆器，杆与壁间间隙0.5～0.6μm,14.4kr/min上下匀浆4～6次，每次5S。
3．过滤匀浆液，150g离心10min，保留上清，沉淀部分加入50μl介质，用匀浆器1kr/min匀浆3次，150g离心10min，沉淀部分再加入上次匀浆的上清液。
4．合并3次上清液，2kg离心10min，弃上清，沉淀部分溶于100μl介质，离心10min，弃上清，留沉淀。
5．将沉淀部分加入70%蔗糖15份，然后分别置于三个离心管中，上面依次叠加54%、49%、45%，41%，37%蔗糖溶液各2、2、5、5、3份。
6．700kg离心90min，分离介质在1.16～1.18之间形成介面。
7．收集d为1.16～1.18g/ml之间的细胞膜，加30倍的介质以2.5kg离心10min，洗涤2次。
8．保存于2.7mmol/L Tris-HCl pH7.5缓冲液中，用于细胞膜的研究分析
8）常用的制备粗制质膜组分的方法：（所有操作都在4摄氏度下进行）
1.在冰冷的匀浆缓冲液中切碎组织块，倒出血水。用匀浆缓冲液漂洗组织碎块，并将它们置于冰上，重复上述操作，直至组织碎成1mm3大小的碎片，且无可见的血。
2.加入5倍（体积比）与组织块体积的缓冲液，再置于冰浴的Dounce氏玻璃匀浆器中，抽研10-20次，匀浆组织。
3.匀浆4摄氏度600g离心10min，上清含细胞膜、线粒体和细胞溶胶。沉淀中有未破碎的细胞及细胞核。弃沉淀。
4.上清4摄氏度8000g离心10min，沉淀线粒体。弃沉淀。
5.上清4摄氏度10000g离心20min，弃上清。
6.用匀浆缓冲液重悬沉淀，继续匀浆，再次4摄氏度，10000g离心20min，弃上清。
7.用小体积的适宜缓冲液重新彻底匀浆沉淀。
8.粗制的样品可于干冰/乙醇中速冻，保存于-80摄氏度。
9）用特殊的去污剂选择性的分离。简单，可靠，但有时含有其他蛋白。
原理：4度时所有的蛋白质原则上都溶于TritonX114水溶液，但在37度时，此溶液分为水相和去污相；此时亲水性蛋白溶于水相，疏水的膜蛋白溶于去污剂相中。
方案
1、放射性标记受试细胞
2、将标记的细胞放在冰上
3、去除上清，用pH7。4的冷磷酸盐缓冲液洗涤单层细胞两次
4、加入1ml2%TritonX溶液冰浴15min
5、刮下单层细胞，4度下10 000g 5min离心
6、溶液37度水浴 10min以分离水相和去污剂相，然后37度下2 000g离心5min
7、收集水相留作分析
8、用500ul冰冷的buffer C溶解去污剂相沉淀，冰浴2min后加温，在按步骤6再次离心
9、按步骤8再次抽提去污剂相，用buffer C将洗涤后的去污剂相稀释到初始体积
10、用等量的buffer A分别稀释水相与去污相，并进行免疫沉淀实验
试剂：
1）2%tritonX114:2%TritonX114、50mmol/L Tris HCl（pH7。5）、蛋白酶抑制剂
2）缓冲液A（含0。5mol/LNaCl的RIPA buffer）
3）buffer C
10mmol/L Tris HCl(pH7.5)
150mmol/L NaCl
5mmol/L EDTA(PH7.5)
10）植物中：高度纯化的质膜是质膜蛋白研究的基础，制备纯化方法也很多，植物材料中以1蔗糖密度梯度离心、2水溶性双水相法、3自由流电泳等方法为主。前两种常用。1的产率较高但纯度不高，2是20世纪80年代发展起来的一种分离高纯度质膜的方法，经多次双水相分配即可得到高纯度质膜，近些年此方法广泛用于植物质膜的纯化。
双向电泳样品缓冲液选用的基本原则（转帖）
本贴转自华大基因培训材料，在此向原作者表示感谢！
1． 蛋白质样品的特征：
复杂，含盐或其他污染物
易被蛋白酶降解
动态范围宽（>106）
溶解性不均一（疏水性/亲水性）
分子量、等电点的范围宽(10-500KDa， pH2-14)
2． 样品分离的基本要求：
高灵敏度和分辨率
宽动态范围
小样品体积
高通量
合适的温度和pH
避免蛋白酶降解
适合与高灵敏度的质谱联用
尽量少的操作步骤减少污染和损失
双向电泳和多维色谱法均符合以上要求，主要讨论双向电泳样品缓冲液的选用
3． 样品缓冲液的组成：
3.1尿素：一种中性变性剂，破坏氨基酸残基之间的非共价键和离子键而不影响等电聚焦，浓度范围5-9.8mol/L，溶液不稳定，降解生成的氰酸根离子与蛋白质的氨基结合改变蛋白质的等电点。加精胺能降低影响。
3.2 硫尿：与尿素一起，能增加疏水膜蛋白的溶解性，缺点是在平衡液里与蛋白的半胱氨酸竞争结合碘代乙酰胺，会使蛋白的烷基化不完全，硫尿还有抑制SDS与蛋白质结合的作用，也可能增加脂类的溶解性，影响二向的效果。一般是2mol/L的硫尿与5-7mol/L尿素结合使用。
3.3 去污剂：蛋白质在去折叠后，会暴露出大量的疏水性残基，去污剂用于破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。阴离子去污剂SDS，不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，浓度不超过0.25%，NP-40:SDS>=8：1，常用的有非离子型去污剂Triton X-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS， ASB-14,C8，SB3-10等。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构，保持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度，但是必须选择合适的浓度，浓度太低不能改善蛋白质的溶解性，浓度太高会使蛋白带变宽，影响分辨率和引起纹理现象。各种去污剂结合使用浓度范围0.5-4%.
3.4还原剂:还原剂能打开蛋白质的二硫键。一般使用β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE），DTT和DTE本身带有电荷，在等电聚焦时会迁移到pH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对使溶解度降低而重新沉淀下来。一般的浓度范围10-100mmol/L,非离子型还原剂如三丁基膦(TBP)2mmol/L能增加蛋白质的溶解性，并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。不过TBP有剧毒，操作时应相当小心，并做好防护工作。
3.5 载体两性电解质：它有两个基本特性，一是两性的，能够在分离柱中达到一个平衡位置，二是可以作为“载体”，能够“运载”电流和pH能力。Biolyte是在丙烯乙胺与乙烯亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中再引入磺酸基团或磷酸基团后合成的。其他特性是分子量小，可溶性好，缓冲能力强，导电性均匀，紫外吸收低，不发荧光，无毒、无生物学效应，具有螯合性质。所有载体两性电解质分子都荷电，只是在溶液中荷正电和荷负电是相等的，所以总的净电荷为零，当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极和阳极移动，当它达到净电荷是零的位置时才停止从而给出一个pH梯度。也必须选用合适的浓度，一般使用的浓度范围是0.2-2%。
3.6 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂能够暂时或者永久性的破坏蛋白酶的活性，减少蛋白质被降解和修饰的可能性。常用的蛋白酶及其作用位点和浓度范围见参考文献1的表2。
3.7 DNase I 和RNase A。消化DNA和RNA，减少污染。
4． 注意事项
见参考文献2，p20-21。
参考文献：
1. (Proteomics 2003, 3, 1408–1417)Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis
2. 《肿瘤蛋白质组学》，陈主初、梁宋平主编，湖南科学技术出版社
3. 《蛋白质电泳实验技术》，郭尧君编著，科学出版社
4. 2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods，安玛西亚公司操作手册
5. 2-D Electrophoresis for ProteomicsA Methods and Product Manual. bio-rad公司操作手册
6. Proteomics in Practice。Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。 Wiley-VCH Verlag GmbH
1． 蛋白质样品的特征：
复杂，含盐或其他污染物
易被蛋白酶降解
动态范围宽（>106）
溶解性不均一（疏水性/亲水性）
分子量、等电点的范围宽(10-500KDa， pH2-14)
2． 样品分离的基本要求：
高灵敏度和分辨率
宽动态范围
小样品体积
高通量
合适的温度和pH
避免蛋白酶降解
适合与高灵敏度的质谱联用
尽量少的操作步骤减少污染和损失
双向电泳和多维色谱法均符合以上要求，主要讨论双向电泳样品缓冲液的选用
3． 样品缓冲液的组成：
3.1尿素：一种中性变性剂，破坏氨基酸残基之间的非共价键和离子键而不影响等电聚焦，浓度范围5-9.8mol/L，溶液不稳定，降解生成的氰酸根离子与蛋白质的氨基结合改变蛋白质的等电点。加精胺能降低影响。
3.2 硫尿：与尿素一起，能增加疏水膜蛋白的溶解性，缺点是在平衡液里与蛋白的半胱氨酸竞争结合碘代乙酰胺，会使蛋白的烷基化不完全，硫尿还有抑制SDS与蛋白质结合的作用，也可能增加脂类的溶解性，影响二向的效果。一般是2mol/L的硫尿与5-7mol/L尿素结合使用。
3.3 去污剂：蛋白质在去折叠后，会暴露出大量的疏水性残基，去污剂用于破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。阴离子去污剂SDS，不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，浓度不超过0.25%，NP-40:SDS>=8：1，常用的有非离子型去污剂Triton X-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS， ASB-14,C8，SB3-10等。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构，保持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度，但是必须选择合适的浓度，浓度太低不能改善蛋白质的溶解性，浓度太高会使蛋白带变宽，影响分辨率和引起纹理现象。各种去污剂结合使用浓度范围0.5-4%.
3.4还原剂:还原剂能打开蛋白质的二硫键。一般使用β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）和二硫赤藓糖醇（DTE），DTT和DTE本身带有电荷，在等电聚焦时会迁移到pH范围以外，从而使某些蛋白质的二硫键重新配对使溶解度降低而重新沉淀下来。一般的浓度范围10-100mmol/L,非离子型还原剂如三丁基膦(TBP)2mmol/L能增加蛋白质的溶解性，并可帮助蛋白质从第一向转移到第二向。不过TBP有剧毒，操作时应相当小心，并做好防护工作。
3.5 载体两性电解质：它有两个基本特性，一是两性的，能够在分离柱中达到一个平衡位置，二是可以作为“载体”，能够“运载”电流和pH能力。Biolyte是在丙烯乙胺与乙烯亚胺缩合并蒸馏得到的多胺混合物中再引入磺酸基团或磷酸基团后合成的。其他特性是分子量小，可溶性好，缓冲能力强，导电性均匀，紫外吸收低，不发荧光，无毒、无生物学效应，具有螯合性质。所有载体两性电解质分子都荷电，只是在溶液中荷正电和荷负电是相等的，所以总的净电荷为零，当引入电场时，载体两性电解质分子将向阴极和阳极移动，当它达到净电荷是零的位置时才停止从而给出一个pH梯度。也必须选用合适的浓度，一般使用的浓度范围是0.2-2%。
3.6 蛋白酶抑制剂：蛋白酶抑制剂能够暂时或者永久性的破坏蛋白酶的活性，减少蛋白质被降解和修饰的可能性。常用的蛋白酶及其作用位点和浓度范围见参考文献1的表2。
3.7 DNase I 和RNase A。消化DNA和RNA，减少污染。
4． 注意事项
见参考文献2，p20-21。
参考文献：
1. (Proteomics 2003, 3, 1408–1417)Sample preparation for two-dimensional gel electrophoresis
2. 《肿瘤蛋白质组学》，陈主初、梁宋平主编，湖南科学技术出版社
3. 《蛋白质电泳实验技术》，郭尧君编著，科学出版社
4. 2-D Electrophoresis using Immobilized pH gradients, principles and methods，安玛西亚公司操作手册
5. 2-D Electrophoresis for ProteomicsA Methods and Product Manual. bio-rad公司操作手册
6. Proteomics in Practice。Dr. Reiner Westermeier, Dr. Tom Naven。 Wiley-VCH Verlag GmbH
双向电泳时理想的样品制备方法的条件
双向电泳时理想的样品制备方法的条件
1,在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。
2,避免溶解性低的蛋白质（如膜蛋白）在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。
3,防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。
4,排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。
5,获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。
样品的全息制备
有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。在进行样品全息制备时必须考虑一切影响等电聚焦（IEF）和凝胶电泳的因素都有应考虑在内。方法可以从简单缓冲液溶解，到应用离液剂（chaotropic agent）、还原剂（reducing agent）、及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂的顺序提取（sequence extracting）及亚细胞器分级等。
离液剂（chaotropic agent）:尿素是最常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5~8mol/L尿素联合使用。
还原剂（reducing agent）:还原剂主要是用来断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有β-巯基乙醇、DTT和三丁基膦等。其中DTT使用比较广泛，在50mmol/L时能有效地还原大部分二硫键，但有些蛋白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度由于它的pKa有8左右，因而会影响到pH梯度。另外，DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。
去污剂:去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂TritonX-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦，然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于0.3%时，对等电聚焦不会产生太大的影响。传统的非离子型去污剂，如Triton X-100和NP-40，以前用得较多，现多数以兼性离子去污剂CHAPS（3-[（3-cholamidopropyl）-Dimethylammonio]-1-Propane sulfonate）代替。CHAPS比其它去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在1%~2%。然而它在高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌
1,在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。
2,避免溶解性低的蛋白质（如膜蛋白）在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。
3,防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。
4,排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。
5,获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。
样品的全息制备
有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。在进行样品全息制备时必须考虑一切影响等电聚焦（IEF）和凝胶电泳的因素都有应考虑在内。方法可以从简单缓冲液溶解，到应用离液剂（chaotropic agent）、还原剂（reducing agent）、及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂的顺序提取（sequence extracting）及亚细胞器分级等。
离液剂（chaotropic agent）:尿素是最常用的离液剂，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2mol/L硫脲和5~8mol/L尿素联合使用。
还原剂（reducing agent）:还原剂主要是用来断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有β-巯基乙醇、DTT和三丁基膦等。其中DTT使用比较广泛，在50mmol/L时能有效地还原大部分二硫键，但有些蛋白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度由于它的pKa有8左右，因而会影响到pH梯度。另外，DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。
去污剂:去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂TritonX-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦，然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于0.3%时，对等电聚焦不会产生太大的影响。传统的非离子型去污剂，如Triton X-100和NP-40，以前用得较多，现多数以兼性离子去污剂CHAPS（3-[（3-cholamidopropyl）-Dimethylammonio]-1-Propane sulfonate）代替。CHAPS比其它去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在1%~2%。然而它在高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌
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john.kingl / 2008-10-30 17:16:42
- 好专业的知识呀！
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- 更新时间: 2009-09-10
