蛋白质测序实验

　　一、概念

　　当前，所谓蛋白质测序，主要指的是蛋白质的一级结构的测定。蛋白质的一级结构(Primary structure)包括组成蛋白质的多肽链数目。很多场合多肽和蛋白质可以等同使用。多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。

　　蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经知道约十万个不同蛋白质的一级结构。

　　二、测定步骤

　　1 多肽链的拆分。由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体;可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).

　　2 测定蛋白质分子中多肽链的数目。通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。

　　3 二硫键的断裂。几条多肽链通过二硫键交联在一起，可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的β-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。

　　二硫键的切割与保护(元素后数字为下标)

　　a 过甲酸〔performic acid〕 不可逆

　　-CH2SO3H

　　b、还原+氧化 不可逆

　　[ 巯基乙醇，DTT ] + 碘乙酸等

　　-S-CH2-COOH

　　c、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕 可逆

　　-R1-S-S-R2 + HSO3-

　　R1-S- + R2-S-SOH3

　　可以通过加入盐酸胍的方法解离多肽链之间的非共价力;应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。

　　巯基(-SH)的保护

　　作用：这些反应(见下图)可用于巯基的保护。

　　

　　4 测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比(如下图)

　　

　　5 分析多肽链的N-末端和C-末端

　　多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸(Carboxyl-terminal) 。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。N末端分析法(Sanger法;Edman法;DNS-Cl;酶降解法)，C末端分析法(肼解法;酶降解法;硼氢化锂法)。

　　6 多肽链断裂成多个肽段。可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。

　　7 测定每个肽段的氨基酸顺序

　　8 确定肽段在多肽链中的次序。

　　利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。

　　9 确定原多肽链中二硫键的位置

　　一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将可能含有二硫键的肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。