高通量药物筛选模型在酶抑制剂筛选上的应用

酶抑制剂的开发是新药开发的重要来源，对于酶抑制剂的药物筛选模型建立来说，动物模型由于规模小、效率低、样品量大、成本高等缺点，不适合作为药物初筛的模型。细胞和分子水平的高通量药物筛选模型，具有材料用量少、药物作用机制比较明确，可以实现大规模筛选和一药多筛等特点，已经广泛应用于酶抑制剂药物的筛选上来。

酶抑制剂是指特异性作用于酶的某些基团，降低酶的活性甚至使酶完全丧失活性的物质，是很多外来化合物产生毒作用的机理。由于抑制特定酶的活性可以杀死病原体或校正新成代谢的不平衡，许多相关药物就是酶抑制剂。

高通量筛选是今年来迅速发展起来的药物筛选技术，它通过运用基因科学、蛋白质科学、分子药理学、细胞药理学、微电子技术等多学科理论和技术，以及与疾病相关的酶和受体为作用靶点，对天然或合成化合物进行活性测试，并在此基础上进行筛选。临床前CRO公司美迪西在抗肿瘤、免疫性疾病、抗炎、心血管疾病、镇痛和糖尿病等研究领域建立了相对成熟的药物筛选模型，既包括微量、快速、高自动化的新型高通量初筛模型，又包括深入筛选的各级复筛模型，形成了高效、多层次的新药筛选平台。

酶抑制剂的高通量药物筛选模型，主要为分子水平的筛选模型，也有少量细胞水平的筛选模型。筛选以酶为作用靶点的药物，不仅要观察酶与药物的结合，更要观察药物对酶活性的影响。根据酶的特点，酶的反应底物和产物都可作为检测指标。以酶为作用靶点的高通量检测方法，绝大多数是直接检测酶的活性，主要有基于放射性的方法和基于比色、荧光的方法两大类。

1、高通量药物筛选模型在5-脂氧化酶抑制剂筛选上的应用

炎症是引起动脉粥样硬化、肿瘤、骨质疏松、哮喘等疾病的重要生理过程，5-脂氧化酶是催化花生四烯酸生成白三烯类炎症介质的关键酶，是抗炎药物研发的重要靶点。以花生四烯酸为底物，以2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸为反应物，建立了非铁离子螯合机制和铁离子螯合机制的两种5-脂氧化酶抑制剂的高通量药物筛选模型。经对酶浓度、反应时间等多种条件的实验、优化和阳性药验证，该模型具有较高的灵敏度和稳定性。

利用建立的非铁离子螯合机制筛选模型，从15200株真菌代谢产物中筛选得到35个阳性菌株，从16702株放线菌代谢产物中筛选得到23个阳性菌株。利用建立的两种筛选模型从2833个单体化合物中筛选到9个有活性的化合物。化合物F01WB287C为铁离子螯合型抑制剂，其IC50值为2μM。化合物F02ZA2396B为非铁离子螯合型抑制剂其IC50值为5.36μM。化合物F02ZA2554A、1833-7、1833-27、F01WA960A、F01WB1695B、1914-1和868通过铁离子螯合和其它机制共同起抑制作用。9个化合物中F02ZA2554A、F01WA960A和F01WB1695B对5-脂氧化酶的抑制活性和阳性药齐留通相当。

该研究筛选到的9个化合物对5-脂氧化酶的抑制活性均未见报道。该研究建立的5-脂氧化酶抑制剂高通量药物筛选模型以及筛选得到的9个新的5-脂氧化酶抑制剂为抗炎药物的研究和开发打下了坚实的基础。

2、高通量筛选模型在流感病毒神经氨酸酶抑制剂筛选上的应用
　　曹鸿鹏等采用荧光分析法建立了流感病毒神经氨酸酶抑制剂的高通量筛选模型，从甲型及乙型流感病毒中制备出神经氨酸酶，以有荧光特性的化合物为酶的底物，利用96孔板建立了适合高通量筛选神经氨酸酶抑制剂的荧光分析法。方法是96孔板中，100 μl体系中含有20 μmol/L MUNANA（底物），3 μl神经氨酸酶溶液，10 μl待测样品溶液，37℃，pH 3.5，孵育15 min，355/460 nm测定荧光强度。
3、高通量筛选模型在α-葡萄糖苷酶抑制剂筛选上的应用

有研究者采用比色法建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。从小肠上段提取α-葡萄糖苷酶，以蔗糖为底物，通过测定体系中葡萄糖的生成量来检测α-葡萄糖苷酶的活性。方法是384孔微板中，20 μl体系中含有10 μl酶提取液，30 mmol/L的蔗糖5 μL，待测样品5 μl，37℃，孵育30 min，505 nm波长下测定吸光度。李婷等也建立了α-葡萄糖苷酶抑制剂的高通量筛选模型。方法是96孔板中，160 μl体系含2.5 mmol/L和0.2 U/ml α-葡萄糖苷酶，37℃，pH 7.0，反应15 min，400 nm波长处测定吸光度。

4、以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法
　　Vollmer等采用放射法建立了一种以青霉素结合蛋白（PBP）为靶的抗生素的高通量筛选方法。PBP既是糖基转移酶又是肽转移酶，该法是筛选其糖基转移结构域的活性位点上的可结合物。方法是96孔板中加入莫诺霉素混悬液，然后加入3H标记的PBP（细菌膜粗提物）和受试化合物，孵育，过滤去掉非结合的放射性，闪烁计数测得放射性指示PBP与莫诺霉素结合的情况及受试化合物对其的影响。

5、醛糖还原酶抑制剂的高通量药物筛选模型建立
　　另外，根据酶的特点，还有一些特殊的方法。肖尚志建立了醛糖还原酶抑制剂的高通量筛选模型。组织贴块法培养大鼠主动脉平滑肌细胞至8～15代时，用胰蛋白酶消化后，接种至24孔板，加入胎牛血清浓度为10%、葡萄糖浓度为37.5 mmol/L的培养液，含药血清20 μl，孵育48 h后，收集细胞，离心取上清液，与辅酶NADPH加上足量的底物在一定缓冲体系中反应。由于NADPH为自身含有荧光的物质，故反应后，高效液相色谱367/455 nm波长下检测荧光强度便可反映NADPH的消耗情况，从而推算出醛糖还原酶的活性。Hammonds等建立了真核生物拓扑异构酶Ⅱ抑制剂的高通量筛选方法。啤酒酵母菌株经改造后使表达人拓扑异构酶Ⅱα或Ⅱβ。将细胞与受试药物在96孔板上孵育后，在630 nm波长处测其吸收度值，从而检测药物对细胞生长情况及酶活性的影响。
　　高通量筛选模型已成功应用于p56lck激酶、DNA拓扑异构酶、醛糖还原酶、神经氨酸酶、环氧化物水解酶、转谷氨酰胺酶等抑制剂的筛选。高通量筛选具有快速、高效、经济、高特异性等优点，其中所用的样品量较少，因此其不仅适用于酶抑制剂药物的筛选上来，还尤其适用于天然化合物的活性筛选。