重组白细胞介素4（IL-4）蛋白表达和纯化研究

白细胞介素4（IL-4）是具有多种免疫学调节功能的细胞因子，具有广泛的生物学活性，临床及研究中需要大量高纯度的IL-4，以及其高效检测试剂。而进行IL-4重组蛋白表达与纯化研究，制备高纯度、高活性的IL-4蛋白对于研究IL-4的生物学功能至关重要。研究表明，糖基化对IL-4的生物学活性可能没有影响，且大肠杆菌表达的IL-4其生物学活性与哺乳动物细胞的表达产物相当，这使人们有可能用原核表达的方式大量生产具有生物学活性的IL-4。

1、人IL-4重组蛋白表达与纯化研究

我国有研究者构建人IL-4重组表达载体，表达纯化并鉴定人IL-4重组蛋白。采用巢式PCR技术从健康志愿者外周血单核细胞(PBMC)总RNA中扩增人IL-4开放阅读框基因，将扩增的IL-4目的基因与表达质粒pET101/D-TOPO连接，转化大肠杆菌BL21，进行表达纯化和鉴定。

结果采用巢式PCR扩增得到IL-4开放阅读框大小为460bp，测序比对显示序列正确。转化BL21后，通过对不同克隆子表达水平的筛选，筛选到高表达IL-4的克隆子，表达和纯化后聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)显示，其融合蛋白大小约为28×10³，与目的蛋白大小一致。western印迹分析法鉴定结果显示表达的蛋白正确，为人IL-4目的蛋白。因此成功表达纯化到人IL-4重组蛋白。

美迪西生物医药在重组蛋白表达与纯化服务方面经验丰富，其拥有多种蛋白表达系统，包括原核蛋白表达系统、酵母蛋白表达系统、昆虫细胞蛋白表达系统（杆状病毒）、哺乳动物细胞蛋白表达系统，具备多种融合技术，可以为客户在蛋白表达与纯化方面提供多种选择。

2、在原核表达载体中，小鼠IL-4重组蛋白表达与纯化研究

构建重组小鼠白细胞介素-4(rmIL-4)原核表达载体，在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达，纯化目的蛋白并鉴定。将优化后的小鼠IL-4 cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a (+)上，获得重组质粒pET32/rmIL-4，转入BL21(DE3)中经IPTG诱导表达得到包涵体。经复性处理后，依次用阴离子交换柱和分子筛纯化蛋白。

对纯化得到的蛋白用western印迹分析法检验免疫学特异性，用mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖实验和动物实验测定其生物学活性。结果发现经酶切和测序证实重组质粒pET32/rmIL-4构建成功，诱导得到的包涵体用3 mol/L盐酸胍溶液洗涤后溶于加有β-巯基乙醇的7 mol/L盐酸胍溶液中变性，在pH9.5的条件下梯度透析复性。纯化出的蛋白经Western blot鉴定，能与抗小鼠IL-4抗体特异性结合。

经细胞和动物实验鉴定，rmIL-4蛋白具有生物学活性，能刺激mIL-4生长依赖性细胞株CTLL-2增殖，使小鼠体内细胞因子发生从TH1到TH2的漂移。因此成功制备了高纯度、具有生物学活性的小鼠IL-4，为进一步研究其生物学功能提供了条件。

3、在大肠杆菌中，缓释的抗炎因子IL-4重组蛋白表达与纯化研究

有研究者通过大肠杆菌重组表达可以缓释的抗炎因子白介素4(Interleukin 4，IL-4)。方法是根据小鼠IL-4的氨基酸序列，并基于大肠杆菌密码子偏爱性合成IL-4的基因，通过聚合酶链式反应(PCR)方法将胶原蛋白结合域(collagen binding domain，CBD)的编码序列和组氨酸标签序列连接到IL-4基因上，运用无缝克隆技术将上述重组基因插入p ET-30a(+)载体。重组蛋白通过组氨酸标签进行纯化，纯化的蛋白被用于诱导M 0巨噬细胞分化成M 2巨噬细胞，同时检测M2巨噬细胞相关基因表达以及对白介素10(Interleukin 10，IL10)的分泌。与Ⅰ型胶原蛋白的联用验证胶原蛋白对重组因子的吸附和缓释功能。

结果带有CBD序列和组氨酸纯化标签的IL-4通过镍柱纯化，具有与商业化IL-4相似的生物活性。功能实验证实其能够被胶原蛋白吸附，并能脱离胶原蛋白缓释。因此通过大肠杆菌表达纯化获得了能够缓释的抗炎因子IL-4。

IL-4是一种多效的细胞因子，调节不同的T和B细胞应答，包括细胞增殖，存活和基因表达。IL-4重组蛋白表达与纯化研究为进一步研究IL-4的生物学功能提供了基础。