紫外分光光度法----核酸的定量

　　原 理:

　　核酸的定量主要采用紫外分光光度法及电泳比较法。组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收值为250～270nm之间。例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm，鸟嘌呤：276nm，胸腺嘧啶：264.5nm，尿嘧啶：259nm。这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核酸的最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为测定核酸溶液度提供了基础。在260nm波长紫外光下，1A值的吸光度相当于双链DNA浓度为50μg/ml;单链DNA或RNA为40μg/ml;单链寡核苷酸为20μg/ml。可以由此计算核酸样品的浓度(紫外分光光度法)。质粒DNA及微量DNA片段的浓度还可以通过与已知浓度的DNA标准同时进行电泳，根据其结合的溴乙锭荧光强度，估计其样品的浓度(电泳法)。

　　操作步骤

　　(一)紫外分光光度法：

　　(二)琼脂糖凝胶电泳比较法：若DNA样品中含RNA或其它杂质，凝胶电泳是一种方便而较准确的定量方法。

　　1. 取2μlDNA样品，加0.4μl电泳上样缓冲液(含溴酚蓝)，混匀后加样于含0.5μg/ml溴乙锭的琼脂糖微型电泳凝胶的孔格内。

　　2. 取一系列浓度不同的2μl标准DNA样品(0.5～50μg/ml)0.4μl上样缓冲液混合上样。标准DNA溶液中，应含有一种与样品DNA分子量大小相近似的DNA分子。

　　3. 电泳：使DNA移入琼脂糖胶内。一般为溴酚蓝迁移2cm左右。

　　4. 将凝胶浸入含0.01mol/L MgCl2的电泳缓冲液中5分钟，进行背景脱色。

　　5. 在短波紫外线(254nm)下进行拍照，比较样品DNA与DNA的标准品的荧光强度，并计算出待测样品中DNA浓度。荧光法灵敏快速。但它的荧光强度决定于溴乙锭嵌入碱基中的多少，这与DNA的超螺旋程度密切相关，标准与样品难以完全一致，并且还受其它影响荧光发光污染物的影响。

　　仪器与器材

　　1. 紫外分光光度计，微量石英比色皿

　　2. 电泳仪，电泳槽，紫外灯。

　　试 剂

　　1. 6×点样缓冲液：0.25%溴酚兰、40%蔗糖

　　2. DNA分子量标准：λDNA/HindⅢ

　　3. 50×TAE电泳缓冲液贮存液配方：(50×)每升 242g Tris， 57.1ml 冰醋酸， 100ml 0.5mol/L EDTA(pH8.0) 1×缓冲液浓度：0.04mol/L Tris-HAc、0.002mol/L EDTA

　　4. 0.8%琼脂糖凝胶：0.8g琼脂糖用100ml 1×TAE沸水浴溶解

　　5. 10mg/ml EB: 1.0g 溴乙锭 100ml 三蒸水