流式细胞技术

　　流式细胞技术

　　流式细胞术概述

　　流式细胞术(Flow Cytometry)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体,是一种对处在液流中的细胞或其他生物微粒，以及人工合成微球逐个进行多种物理或生物学特征快速定量分析和分选的技术。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析,在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析;能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度>95%。 对比起其他技术方法，流式细胞术拥有其明显的特点和优势，因而在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 (1) 快速地細胞分析 (2) 以单一细胞为基础 (3) 定量性荧光分析 (4) 相关性多参数分析 (5) 无需细胞分离步骤 (6) 可分选有关细胞，进行培养或再分析 流式细胞术发展简史 1934年，Moldavan1首次提出了使悬浮的单个血红细胞等流过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并用光电记录装置计测的设想，在此之前，人们还习惯于测量静止的细胞，因为要使单个细胞顺次流过狭窄管道容易造成较大的细胞和细胞团块的淤阻。1953年Crosland–Taylor根据雷诺对牛顿流体在圆形管中流动规律的研究认识到：管中轴线流过的鞘液流速越快，载物通过的能力越强，并具有较强的流体动力聚集作用。于是设计了一个流动室，使待分析的细胞悬浮液都集聚在圆管轴线附近流过，外层包围着鞘液;细胞悬浮液和鞘液都在作层液。这就奠定了现代流式细胞术中的液流技术基础。

　　1956年，Coulter在多年研究的基础上利用Coulter效应生产了Coulter 计数器。其基本原理是：使细胞通过一个小孔，只在细胞与悬浮的介质之间存在着导电性上的差异，便会影响小孔道的电阻特性，从而形成电脉冲信号，测量电脉冲的强度和个数则可获得有关细胞大小和数目方面的信息。1967年Holm等设计了通过汞弧光灯激发荧光染色的细胞，再由光电检测设备计数的装置。1973年Steinkamp设计了一种利用激光激发双色荧光色素标记的细胞，既能分析计数，又能进行细胞分选的装置。这样就基本完成了现代FCM计数技术的主要历程。

　　现代的FCM数据采集和分析技术是从组织化学发源的，其开拓者是Kamentsky。1965年，Kamentsky在组织化学的基础上提出了两个新设想：(1)细胞的组分是可以用光光度学来定量测定的，即分光光度术可以定量地获得有关细胞组织化学的重要信息。(2)细胞的不同组分可以同时进行多参数测量，从而可以对细胞进行分类。换句话说，对同一细胞可以同时获得有关不同组分的多方面信息，用作鉴别细胞的依据。Kamentsky不仅思路敏捷，而且能身体力行。他是第一个把计算机接口接到仪器上并记录分析了多参数数据的人，也是第一个采用了二维直方图来显示和分析多参数的人。 流式细胞术在细胞化学中的应用的先驱者是Van Dilla和美国的Los Alamos小组。他们在1967年研制出流液束、照明光轴、检测系统光轴三者相互正交的流式细胞计的基础上，首次用荧光Feulgen反应对DNA染色显示出DNA的活性与荧光之间存在着线性关系，并在DNA的直方图上清楚地显示出细胞周期的各个时相。Gohde 和Dittrich接着把这项技术推向实用，他们用流式细胞术测定细胞周期借以研究细胞药代动力学问题。FCM用于免疫组织化学中的关键是对细胞进行免疫荧光染色，其它和在细胞化学的应用并没有多大差异。 近20年来，国内外在FCM上都做了不少的研究和应用工作，也取得了不少成果。特别是随着仪器和方法和日臻完善，人们越来越致力于样品制备、细胞标记、软件开发等方面的工作以扩大FCM的应用领域和使用效果。FCM在免疫组织化学中的应用也大致差不多，并注重了在临床应用的推广 流式细胞仪

　　1. 流式细胞仪概述

　　流式细胞仪(Flow Cytometer，FCM)是流式细胞术的主要设备。它是通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，来快速分析颗粒的物理或化学性质，并可以对细胞进行分类收集的高精密仪器。流式细胞仪可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个细胞特征参数，进行定性或定量分析，具有速度快、精度高、准确性好等特点。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家Beckman-Coulte公司(产品如EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL)和Becto n-Dickinson公司(产品如FACS Vantage、 和FACS Canto等)生产。流式细胞仪主要有两三类:(1)临床型(又称小型机、台式机)，其特点是仪器的光路调节系统固定，自动化程度高，操作简便，易学易掌握。(2)综合型(又称大型机、分析型)，其特点是分辨率高，可快速将所感兴趣的细胞分选出来，并可以将单个细胞或指定个数的细胞分选到特定的培养孔或培养板上，同时可选配多种波长和类型的激光器，适用于更灵活的科学研究。(3)新型流式细胞仪，随着激光技术的不断发展，仪器选用多根激光管，多时可同时检测十几个荧光参数。还可以实现高速分选，速度达到50000个/每秒。通过激光技术与显微拍摄技术的结合，产生了更新的图象流式细胞技术和仪器(如Amnis公司的ImageStream System)，可以得到更多的参数和实验效果，极大地满足了科学研究的需要。 流式细胞仪主要技术指标： (1)流式细胞仪的分析速度：一般流式细胞仪每秒检测1000～5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。(2)流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上