高效液相色谱仪测定氨基酸的含量

　　1L--色氨酸含量的测定

　　1.1实验仪器与试剂

　　色氨酸样品，甲醇，STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站，0.03%KH2PO4溶液

　　1.2HPLC色谱分析条件

　　流动相为0.03%KH2PO4溶液(A)-甲醇(B)，线性梯度淋洗，流速1.0mL/min，柱温35℃，检测波长276nm。

　　流动相时间(t/min)

　　5101520

　　A(%)80908070

　　B(%)20102030

　　1.3标准溶液的配制

　　精密称取色氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。

　　1.4标准直线的制作

　　精密称取色氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml中含色氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg的溶液，注入液相色谱仪，以色氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。

　　1.5发酵液中样品中色氨酸含量的测定

　　取发酵液，稀释配制成约500μg/ml的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。

　　2L-精氨酸含量的测定

　　2.1实验仪器与试剂

　　L-精氨酸标准样品，乙腈，STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站，磷酸二氢铵。

　　PH计，磷酸，

　　2.2HPLC色谱分析条件

　　流动相:以磷酸二氢铵溶液(称取磷酸二氢铵1.15g,加水800m溶解后,用磷酸调节pH值至2.0±0.1,加水稀释至1000ml)-乙腈为流动相，线性梯度淋洗;柱温为30℃检测波长为206nm;进样量：25μl。

　　2.3标准直线的制作

　　精密称取精氨酸标准标准品50mg，置100ml容量瓶中，振摇，用流动相溶解到刻度，作为供试品溶液，另取色氨酸样品适量，同法操作。精密称取精氨酸标准样品适量,分别稀释制成每1ml中含精氨酸50.0、100.0、200.0、400.0、600.0、800.0、1000.0μg的溶液，注入液相色谱仪，以精氨酸峰面积A为纵坐标，浓度C为横坐标，制作回归标准直线。

　　2.4发酵液中样品中精氨酸含量的测定

　　取发酵液，稀释配制成约500μg/ml的溶液，摇匀，过滤，取25μl进样，在高效液相色谱仪下测量，记录峰值面积，作图。

　　3L-甘氨酸含量的测定

　　3.1实验仪器和试剂

　　乙酸铵溶液;乙腈;L-甘氨酸标准样品;STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站。

　　3.2HPLC色谱分析条件

　　流动相:A为0.02%mol/L乙酸铵溶液(PH=6.5):B为乙腈，线性梯度淋洗;流速:110mL/min;柱温:30℃;进样量:20μL。

　　梯度洗脱表3

　　流动相时间(t/min)

　　102030405060

　　A(%)806040406080

　　B(%)204060604020

　　3.3标准直线的制作

　　方法同2.2节

　　3.4发酵液中样品中甘氨酸含量的测定

　　方法同2.5节

　　4L-甲硫氨酸含量的测定

　　4.1实验仪器和试剂

　　L-甲硫氨酸标准样品;甲醇;醋酸钠;STI501液相色谱仪梯度系统，UV501紫外检测器，7725I手动进样阀，N2000色谱工作站。

　　4.2HPLC色谱分析条件

　　流动相:A为甲醇,B为50mmol/L的醋酸钠缓冲溶液;流速1.0mL/min;梯度洗脱见表1，测定波长为262nm，柱温为30℃。

　　梯度洗脱表4

　　流动相时间(t/min)

　　102030405060

　　A(%)30508085100100

　　B(%)7050201500

　　4.3标准直线的制作

　　方法同2.2节

　　4.4发酵液中样品中甲硫氨酸含量的测定

　　方法同2.5节

　　5回收率实验

　　称取甘氨酸标准液50μg/ml分别稀释0、1、2、4、6、8、10倍，每份取1ml，按标准样品处理方法，过滤，测定标准样品中的甘氨酸的含量，计算回收率。