内容摘要:样品前处理 ①称取样品50 g于三角烧瓶中,加95%乙醇100 mI。,KOH 12 g,装上冷凝管,于水浴(95℃)加热回流3
h,取下三角烧瓶,样液滤入装有100 mI。水的分液漏斗中。 ②依次用乙醇50 mL、环己烷150 mL分两次洗三角烧瓶,过滤后一并收于分液漏斗中,振摇3
rain,静置分层,下层液放于第二只分液漏斗中,再用环己烷70 mI.提取3 rain,分层后,弃水层。 ③环己烷提取液合并于第一只分液漏斗中,用环己烷8
mI-,淋洗漏斗,洗液一并收入。用40℃100 mI。水洗环己烷提取液3次,水洗液合并于第二只分液漏斗中,用环己烷30 mI.提取1次,振摇1
min,分层后弃水层。再用40℃水50 mI。重复一次。 ④全部环己烷提取液经层析柱纯化,用100 mL苯淋洗层析柱,流速2
mL/min。洗脱液用K—D浓缩器浓缩至0.1-10.5 mL,待检。
苯并(a)芘残留检测
环境污染与食品加工(如烟熏、烧烤等)是造成食品中多环芳烃残留的重要途径。苯并(a)芘残留检测方法有乙酰化纸层析-荧光分光光度法和高效液相色谱法。
乙酰化纸层析一荧光分光光度法
l.原理
样品经脱水后,用环己烷在脂肪抽提器中抽提,或经皂化后抽提;提取液经液一液分配后,再经柱层析纯化、浓缩;浓缩液在乙酰化纸上点样、展开、分离出的B(a)P在紫外光(波长365nm或波长254nm)下照射产生蓝紫色荧光斑点,然后溶出荧光物质,用荧光分光光度计检测其荧光强度(激发波长
386nm、发射波长405nm),与标准比较定量。
2.仪器荧光分光光度计及紫外灯(波长365 nm)。
3.试剂
①环己烷(重蒸)。
②二氯甲烷(重蒸)。
③苯(重蒸)。
④醋酸酐。
⑤浓HzS04。
⑥KOH。
⑦无水NazS04。
⑧硅胶(60-1100目)。
⑨中性Al203(100~200目),经130℃活化4h。
⑩B(a)P标准贮存液[100 ugB(a)P/mL]:准确称取纯品苯B(a)P10.omg,用环己烷溶解并定容至100mL。
⑪B(a)P标准溶液:1ugB(a)P/mL。
⑫乙酰化试纸的制备:将层析用滤纸裁成5cm×20cm纸条,浸入盛有300mL苯、260mL醋酸酐和0.2mI。浓H:SO。的层析缸中,不断搅拌4h后,过夜,取出纸条在通风橱内晾干,用蒸馏水洗2-13次晾干后,放人无水乙醇中浸泡4h,取出晾干压平。
4.样品前处理
①称取样品50g于三角烧瓶中,加95%乙醇100mI。,KOH12g,装上冷凝管,于水浴(95℃)加热回流3h,取下三角烧瓶,样液滤入装有100mI。水的分液漏斗中。
②依次用乙醇50mL、环己烷150mL分两次洗三角烧瓶,过滤后一并收于分液漏斗中,振摇3rain,静置分层,下层液放于第二只分液漏斗中,再用环己烷70mI.提取3rain,分层后,弃水层。
③环己烷提取液合并于第一只分液漏斗中,用环己烷8mI-,淋洗漏斗,洗液一并收入。用40℃100mI。水洗环己烷提取液3次,水洗液合并于第二只分液漏斗中,用环己烷30mI.提取1次,振摇1min,分层后弃水层。再用40℃水50mI。重复一次。
④全部环己烷提取液经层析柱纯化,用100mL苯淋洗层析柱,流速2mL/min。洗脱液用K—D浓缩器浓缩至0.1-10.5mL,待检。
5.纸层析
①点样:在乙酰化滤纸一端5cm处,用铅笔划一横线,用微量注射器吸取样品浓缩液(10-150/uL),同时点B(a)P标准溶液(1ug·mL-1)20uL。
②展开:将点样后的乙酰化纸上端挂在圆柱形层析缸缸盖的挂钩上,层析缸内加30mL无水乙醇、5mI.二氯甲烷为展开剂,纸的下端浸入溶剂约lcm,在避光处展开,待展开剂前沿上升到距纸顶lcm时取出晾干。重复操作2~3次。
③紫外灯下照射:取展开后的乙酰化纸于紫外灯(波长365nm)下照射,用铅笔圈出B(a)P标准点相应位置的荧光带,用剪刀剪下圈内的这一部分,并剪成小碎片,放人具塞小试管中,准确加5mL苯,盖紧后于60℃水浴加热20min,在其间摇匀2次,冷却待检。
6.荧光测定
①定性分析:将检测液移人石英杯中,置于荧光分光光度计上,调节仪器参数,将激发波长固定在386nm,对检测液和标准液分别在发射波长400~500nm间扫描,绘出发射光谱图(图20—5),再将发射波长固定在405nm,激发波长于250~400Flm间扫描,绘出激发光谱图(图20一6)。如两者图谱相同,就确认为苯并(a)芘。
②定量分析:将激发波长固定在38613.m,分别测定405nm、400nm、410nm处测定液和标准液的荧光强度,然后用基线法求出在405nm处的峰高值。
Y = I1/I0×Y0×1000/m
式中:Y——待检液B(a)P含量,ug/kg;
Y0——标准液B(a)P含量,ug/kg;
I1——检测液的荧光强度;
m——样品质量,g。
7.说明
①熟肉制品试样处理应先加水30mL和KOH12g,放置30min后再加乙醇100ml。
②用40℃温水洗环己烷提取液时,第一次轻摇15次,第二次轻摇30次,最后振摇1min,避免剧烈振摇,防止乳化。
③层析柱下端放少量脱脂棉,先装入10g硅胶,后装3g中性A120。,装时注意使装好的柱中没有气泡。层析柱中也可填人硅镁型吸附剂(60-1100目)。该试剂处理参照黄曲霉毒素检测的高效液相色谱法。
④于脂肪提取器中放人脱脂药棉,用环己烷浸泡,在水浴上经抽提4h以上,取出晾干。
⑤也可采用薄层层析法来检测。在硅胶G薄层板上点不同系列标准液与待测液,然后用异辛烷展开3次,取出,在暗处稍晾干,置紫外光灯下(波长365nm)观察,分别划出所有荧光部分,再分别刮下后各加95%乙醇5mI。,振摇离心后,分别取上清液于荧光分光光度计下,用激发波长386nm检测,标准系列根据荧光波长406nm处测得的峰高值,绘制标准曲线,样液根据荧光波长406nm处的峰高值,从标准曲线查得苯并(a)芘的含量。