利用SMART技术进行酵母双杂交文库构建的研究

研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用不仅对于揭示生命活动如生长、发育、分化和凋亡等的机制具有重要的意义，而且为治疗各种重大疾病和药物研发等提供重要的理论基础。酵母双杂交系统是目前应用广泛的一个较为成熟的研究蛋白质间相互作用的系统，越来越多的生物公司提供酵母双杂交服务。酵母双杂交技术是一种直接在酵母细胞内检测蛋白质相互作用的方法，可以有效地筛选与已知靶蛋白相互作用的蛋白质，确定参与结合作用的结构域。  

酵母双杂交技术的应用主要包括从基因文库中寻找到与已知蛋白相互作用的未知蛋白，验证两种已知蛋白之间的相互作用，在基因治疗中找到药物的作用位点，同时可绘制蛋白质的连锁图谱并找到其作用的活性位点等。利用酵母双杂交系统技术来筛选cDNA文库中与目的蛋白相互作用的蛋白质，通常是把目的蛋白和BD相连，cDNA和AD相连构成cDNA文库。 

酵母双杂交文库构建是筛库的前提，其构建主要有2种策略，一种是合成的cDNA在体外通过连接酶和载体相连，然后转化细胞。另一种是SMART技术，指的是合成的cDNA和线性化的载体共同转化酵母，在体内重组酶的作用下cDNA和载体相连形成完整的质粒。通过SMART技术构建的cDNA文库能够代表原有样品中的mRNA的丰度，保存了生物遗传信息的完整性。美迪西提供酵母双杂交服务，其具有独立优质实验室，专业实验人员，提供详细的酵母双杂交实验步骤、原始数据和图片、结果分析，可以出具权威检测数据报告。

1、利用SMART技术可进行中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库构建

针对人类肝脏蛋白质组计划中大规模基因克隆及构建肝脏蛋白相互作用图谱的研究需要，研究者改造了酵母双杂交载体pPC86和pDBleu，并构建中国人肝组织cDNA文库，为肝脏蛋白质组计划的研究奠定基础^[1]。方法是设计并合成特定寡核苷酸序列，经过处理形成具有黏性末端的双链DNA片段，插入到pPC86、pDBLeu载体相应的酶切位点处，从而获得改造的新载体。

利用改造后的载体、中国人正常肝组织mRNA和Clontech SMART文库构建试剂盒构建NpDBLeu-cDNA文库。结果发现酶切鉴定和DNA测序证实改造后载体插入位点和序列正确，成功获得新载体NpPC86和NpDBLeu。滴度测试表明，所构建NpDBLeu肝组织cDNA文库容量为1.93×10⁶cfu，转化子重组效率为95.2%，扩增文库达到109cfu•mL^-1。因此利用SMART技术可成功构建中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库。

2、利用SMART技术可进行大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交文库构建

有研究者构建了脂多糖(LPS)和地塞米松(Dex)作用后的肺泡巨噬细胞(AMs)酵母双杂交cDNA文库，探寻炎症条件下与糖皮质激素受体(GR)相互作用的蛋白质分子^[2]。方法是用LPS和Dex作用于原代培养的肺泡巨噬细胞4h后，从肺泡巨噬细胞中提取总RNA，再以SMARTⅢTM和CDSⅢoligo(dT)为引物进行PCR扩增，得到两端具有同源臂的双链cDNA。后者纯化后，与线性质粒pGADT7-Rec共转化感受态酵母菌AH109，二者在酵母细胞中同源重组成环形的有复制活性的cDNA文库质粒，收集在缺亮氨酸(Leu)培养板上筛选出所有克隆，即为AMs酵母双杂交文库菌。进而通过诱饵质粒pGBKT7-GR转化构建成功的文库菌，筛选与GR相互作用的蛋白分子。

结果构建了具有基因多样性和库容量足够大的AMscDNA文库，共获得1.07×10⁶个转化子，插入的双链cDNA片段的长度在0.3~1.5kb之间。筛选文库获得1个真阳性克隆，经测序和同源性比较证实该克隆为BAG-1。研究发现利用SMART技术可成功构建肺泡巨噬细胞的酵母双杂交cDNA文库；GR与BAG-1在酵母细胞中存在着相互作用。

利用酵母双杂交技术不仅可以发现新的蛋白质和发现蛋白质的新功能，以及建立基因组蛋白连锁图，还可以在细胞体内研究抗原和抗体相互作用。在新药研发方面，酵母双杂交技术还可以筛选药物的作用位点以及药物对蛋白质之间相互作用的影响。相信，在未来随着科学技术的发展，酵母双杂交技术的应用前景将会越来越广阔。

[1] 利用SMART技术构建中国人肝组织cDNA酵母双杂交文库[J].

[2] 大鼠肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与筛选[J].