免疫组化染色常用的标记物有哪些

免疫组织化学是一项在医学基础与临床科研中被广泛应用的一项技术，免疫组化染色服务也是生物公司的一项常规服务之一。该技术融合了抗原和抗体特异性结合的免疫学技术与组织学技术，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色，来对组织或细胞内抗原进行定位和定量研究。肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等，它们的组织细胞内具有抗原性的物质，所以均可以用免疫组织化学方法显示。免疫组化常用的显色剂包括荧光素、酶、生物素和铁蛋白等。

免疫组化染色和Western印迹分析、ELISA技术是免疫学研究的3大工具，分别用于定位、定性和定量研究。免疫组织化学把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质，并可在原位显示相应的基因和基因表达产物。收集整理网络上的资料，归纳一下免疫组化染色常用于的标记物。

1、异硫氰酸荧光素（FITC）

FITC性质稳定，易溶于水和乙醇，能与蛋白质结合，是检测组织细胞内蛋白质较为常用的荧光探针。它还能标记抗体，可用于免疫组织化学单染或多重染色，其缺点是在光照下容易淬灭，易受自发荧光影响。最大激发光波长为490nm；最大发射光波长为525nm，呈现黄绿色荧光。免疫组化染色是医学和生命科学研究中经常要使用的研究方法。美迪西提供免疫组化染色服务，其生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。

2、四乙基罗丹明（RB200）

RB200能与细胞内蛋白质结合，不溶于水，易溶于乙醇和丙酮，性质稳定，可长期保存，广泛应用于双标记示踪染色。最大激发光波长为570nm，最大发射光波长为595-600nm，荧光显微镜下发橙红色荧光。

3、四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)：

该荧光素能与细胞内蛋白质结合，比FITC稳定性好，在生理条件下对pH值变化不敏感，荧光强度受自发荧光干扰小。最大激发光波长为550nm；最大发射光波长为620nm，呈橙红色荧光，与FITC发出的黄绿色荧光对比鲜明，常用于免疫荧光组织化学双重染色。

4、花青类染料

常用的有Cy3、Cy5等，能与细胞内蛋白质结合。这类染料的荧光特性与传统荧光素类似，但水溶性和对光稳定性较强，荧光量子产率较高，对pH等环境不敏感。常用于多重染色。

5、乙酸甲酯

其本身不发荧光，但透膜进入细胞质后，在酯酶的作用下转变为具有荧光特性的乙酸甲酯。其激发光谱有pH依赖性，是使用最多的细胞内pH荧光指示剂。最大激发光波长为505nm，最大发射光波长为530nm，呈绿色荧光。

6、Indo-1

Indo-1是典型的双发射荧光探针，无钙时在485nm左右有发射峰，结合钙后，则在405nm处有发射峰，两者的比值与细胞内游离钙离子浓度成线性关系，将此比值与标准曲线相比即可得出细胞内游离钙浓度，因此，可利用此探针定量检测细胞内游离钙离子浓度。

7、量子点(quantum dot)

量子点是近年来研制的一种新型荧光染料，又称半导体纳米晶体，是由几百或几千个纳米级颗粒构成的半导体材料，性质稳定，溶于水，细胞本身不能合成和组装。量子点具有荧光时间长、产生多种颜色、检测方便和应用范围广等优点。

8、辣根过氧化物酶

辣根过氧化物酶是一种糖蛋白，由于在辣根中该酶的含量很高，故得名。它以铁卟啉为辅基，在过氧化氢存在时能催化苯酚、苯胺及其取代物聚合。通常用做光学和电子显微镜的组织化学示踪物。该酶比活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以较为常用，不但可以用于免疫组化染色，也广泛运用于免疫类（ELISA）试剂盒。过氧化物酶作为多个试剂盒显色体系的关键成分，对试剂盒的质量有重要影响。

9、碱性磷酸酶

碱性磷酸酶（AKP），又称碱性磷酸单酯酶，是酶组织化学中最常用的酶之一。分布广泛，常见于活跃运输的膜上。该酶在碱性环境下能催化各种醇和酚的磷酸酯水解，最适pH为9.2-9.4，可被Mg2+、Mn2+和某些氨基酸所激活；氰化物、碘液、砷酸盐等可抑制其活性。显示AKP的方法很多，主要有钙钴法和同时偶联法。前者所需试剂便宜，容易购买，操作简单，但会出现假阳性。后者方法较灵敏，而且在正常组织内不存在萘酚，因此不会出现假阳性，但所需试剂较难购买。

10、生物素（biotin）

生物素是B族维生素之一。生物素在羧化、脱羧和转羧化反应中起辅酶作用。生物素是含硫水溶性维生素。广布于动物及植物组织，已从肝提取物和蛋黄中分离，是多种羧化酶辅基的成分。生物素标记反应简单、温和且很少抑制抗体活性，生物素标记的抗体可存放多年而不失活。能与生物素结合的二级试剂素，所需的各种标记物均可购置。此外，亲和素和链霉亲和素的结合背景水平非常低，结合紧密且快速，抗体很容易与经过化学修饰的活化生物素结合。生物素又可以与结合有酶、荧光染料的亲和素或链霉亲和素连接，后者已有商品试剂供应。这样只需将纯化抗体与生物素结合，就可用各种不同的标记物来检测。

11、金属离子和金属蛋白复合物

金属离子和金属蛋白复合物如铁蛋白、金和汞可以作为免疫组化反应中的标记物。如铁蛋白等，主要应用于免疫电镜。免疫金银法的基本原理是用特异性抗体与抗原反应，随后用金标记的间接抗体或SPA蛋白，再与特异性抗体结合，用乳酸银处理，使银颗粒沉积在金颗粒上，还原银反应而显示出黑褐色。适用于石蜡切片、冰冻切片，培养细胞，细胞涂片和树脂包埋的电镜切片。这种方法敏感性高，可检测组织中微量抗原，定位准确、无扩散现象且背景清洗，对比度好、方法简便。