甲醛变性电泳检测RNA完整性

　　甲醛变性电泳检测RNA完整性

　　一、材料、试剂和仪器

　　1、材料：植物总RNA 5-10μg

　　2、试剂：

　　1)加样运载缓冲液(Loading buffer)

　　50% 甘油

　　1mmol/L EDTA (pH 8.0)

　　0.25%溴酚蓝

　　25%二甲苯氰FF

　　2)10×TAE Buffer

　　3)5×甲醛凝胶电泳缓冲液：

　　0.1mol/L MOPs (pH7.0)

　　40mmol/L乙酸钠

　　5mmol/L DETA(pH8.0)

　　4)甲醛，甲酰胺

　　3、仪器：电泳装置，紫外透射观测仪

　　二、实验程序

　　1、甲醛变性的琼脂糖(Agarose) 凝胶的配制

　　在250mL的锥形瓶中准确称量2g Agarose (Sigama)，再加20mL 10×TAE Buffer，144mLDEPC处理过的双蒸水，微波炉中化胶，待冷却至50-60℃加EB至终浓度≤0.5μg/mL。在通风橱中加入36 mL甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。

　　2、RNA的甲醛变性电泳

　　1) 样品制备

　　RNA总量10μg

　　5×甲醛凝胶电泳缓冲液4μl

　　甲醛 3.5μl

　　甲酰胺10μl

　　加入无菌离心管中混合，95℃水浴变性2min(或55℃，15min)，取出后放入冰中冷却。

　　2) 加入2μl无菌的DEPC处理的加样运载液。(使用加样运载液的目的有三： 增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内;使样品呈现颜色，便于加样操作;能明确显现样品在电泳胶上的泳动位置。以 0.5 X TBE作电泳液时，溴苯酚在琼脂糖中的泳动速率与长 300 bp 的双链线状DNA相同，而二甲苯氰FF 的泳动速率与长4kb 的双链线状DNA相同。)

　　3)将胶板浸没在1×甲醛凝胶电泳缓冲液中，点样前5V/cm预跑5min。点样后3-4V/cm电泳。

　　4)电泳结束后(溴苯酚蓝迁移到约8cm处)，紫外灯下观察， 照相