免疫分析技术----荧光免疫测定法与酶免疫测试法

　　内容摘要：在农药残留分析中用的最多的是酶联免疫吸附测定法，很适合携带到现场监测，对于呈阳性反应的继之以气谱或液谱测定，可以减少不必要的浪费和污染，适应了环保的需要。

　　1.荧光免疫测定法

　　荧光免疫测定法(FIA)是将抗血清、待测农药、荧光标记的待测农药混在聚苯乙烯管中，经培育后加入广球蛋白和分子量为6000的聚乙二醇使与之结合的待测农药和荧光标记的农药沉淀下来;未被结合的荧光标记的农留在上清液中。当抗血清与荧光标记农药的量一定时，含待测农药多的试管中，抗体结合的荧光标记农药少，上清液中游离的荧光标记的农药就多，即待测物含量与游离的荧光标记物含量成正比，测定上清液的荧光强度，即可算出待测物含量。

　　S.A.EreminLH。]报道了用偏振荧光免疫测定法(PFIA)来检测许多环境样品中的农药残留。当荧光团标记半抗原被特别的抗体束缚时，PFIA就提高了荧光的极化，当自由分析物与半抗原为结合而竞争时，就减弱了信号;该法并不需要分离自由态和结合态的分析物。PFIA法适合于检测西玛津、阿特拉津等，10个O.05mI。的水样在7min内即可分析完毕;阿特拉津的检出限为100ng/mL，西玛津为5ng/mL，变异系数小于5%。calatayud[H’]报道了用FIA测定3吲哚乙酸杀虫剂，具有高选择性，线性范围 0.005～O.6mg/L，相对标准偏差为4.9%。

　　2.酶免疫测试法

　　农药残留检测中最常用的是酶免疫法。近年来，免疫分析法尤其是酶免疫分析(EIA)的研究十分活跃，应用领域也取得了较大的扩展。EIA被称为使用抗体作为“生物化学检测器”的分析技术，是基于抗原抗体特异性识别和结合反应为基础的分析方法。大分子量的农药(如苏云金杆菌毒素等)可以直接作为抗原免疫脊椎动物，动物的免疫系统对进入体内的异源大分子量物质发生保护性应答反应。

　　1975年首次成功地将EIA用于狄氏剂残留的测定。20世纪80年代中期以来，EIA在农药分析中的应用日益增多，且逐渐由多抗转向单抗，其检测手段多为ELISA。近年来，国内外已经开发出40多种农药的EIA方法，其中用于田间快速筛选的EIA试剂盒已商品化。EIA在除草剂和杀虫剂中应用较多，而杀菌剂较少。Brandon[¨。]等利用EIA分析食品中的苯并咪唑农药残留。EIA具有特异性强、灵敏度高(检测限可达10叫～10叫。)、方便快速、分析容量大、分析成本低、安全可靠等优点。EIA也有其局限性和不利之处，如：开发过程需要投入较多的资金和时问，得到一个好的抗原并不容易，对试剂的选择性高，很难同时分析多种成分，对结构类似的化合物有一定程度的交叉反应。农药酶免疫测试法是用酶标记抗原、半抗原或抗体而建立的方法。根据其特点和步骤可分为酶联免疫吸附测定法(ELISA)和酶放大免疫测试法(EMIT)。

　　(1)酶联免疫吸附测定法 20世纪80年代，食品农药残留的免疫学检测技术研究取得了较大的进展，特别是酶联免疫吸附技术使用最为广泛。ELIsA是一种主要的免疫分析方法，又可分为直接竞争法和问接竞争法。直接竞争法是将抗体包被到聚苯乙烯微孔反应板上，加入酶标记农药和待测农药，酶标记农药和待测农药之间与抗体的竞争而发生结合反应，反应完后，倒掉反应液并洗涤，待测农药多，则被吸附到反应板上的酶标记农药少，即吸附到酶反应板上的酶标记农药的量与待测液中农药的含量成反比。加入酶底物显色后，进行比色，可以测定待测农药含量。间接竞争法的前一部分与抗原包被直接竞争法相同，只是不用酶标记农药抗体(一抗)，而是标记第二抗体，在竞争反应结束后，加入酶标二抗，发生一抗与酶标二抗的结合反应，被结合的酶标二抗的量与包被抗原结合的一抗的量的变化趋势是一致的，即被结合的酶标二抗的量与待测农药的含量成反比。此方法的优点是一个农药抗体可以结合多个酶标二抗，大大提高了方法的灵敏度。

　　在农药残留分析中用的最多的是酶联免疫吸附测定法，很适合携带到现场监测，对于呈阳性反应的继之以气谱或液谱测定，可以减少不必要的浪费和污染，适应了环保的需要。 EuSA利用酶标记抗体或抗原，通过抗原与抗体之间的ELISA反应依靠比色法来确定农药的残留量，该方法特异性强、灵敏度高、快速、灵敏、价廉、不需烦琐的预处理，已经成为现场分析的首选方法。该方法的缺点是制备抗体较困难，可能会出现假阳性或假阴性现象。一些检测商品试剂盒也相继研究开发出，美国Immuno systems公司在1991年已生产出10余种以ELISA为基础的农药酶免疫速测箱，用于测定水、果汁以及部分食品乙腈提取液中的杀虫剂、杀菌剂、除草剂，检测限在。mg/kg级，与HPLC比较有较好的相关性。

　　在1994年制备了一种可以与苯并咪唑类药剂(丙硫多菌灵、芬苯达唑、奥芬达唑及它们的代谢物)结合的单克隆抗体，该抗体也可与甲基苯并咪唑氨基甲酸酯(苯菌灵的一种代谢物)结合。新的半抗原5(6)一(羟基戊基一硫代)一2一苯并咪唑氨基甲酸酯可在大鼠体内得到，这种改进了的EI。ISA法可以检测苯并咪唑及多种农药，它们的检出限为1～8pg/kg。Brandon[143’报道了可用单克隆抗体ELISA法来检测西红柿和苹果中的噻菌灵，噻菌灵用水或缓冲液萃取即可，这种单克隆抗体可与噻菌灵结合，ELISA法对噻菌灵的检出限小于0·2mg/kg，由于美国联邦政府规定的噻菌灵在西红柿和苹果中的限定浓度为10mg/kg，故该法能直接满足要求。Selisker‘等[’。。]采用竞争ELlsA法用兔抗百草枯抗体包被磁株固相检测百草枯，从各种水果和蔬菜中提取百草枯只用30min，检出限为10ng/g，平均回收率达99%，而用分光光度计法样品提取则需5h，两种检测方法相关系数达 o.994Schiaeppi等[145]运用直接竞争ELISA法和间接竞争ELISA法分别检测土壤中的异丙甲草胺，产生的抗异丙甲草胺单克隆抗体有极强特异性，与其代谢产物无交叉反应，直接和间接竞争EusA法对土壤中异丙甲草胺的回收率分别为98%和89%。Clegg等[H。]建立了分析甘膦的 ELIsA法，其工作范围为10～1000/~g/mL，检出限为7.6肛g/mL。

　　研究表明，甲萘威的EUSA技术线性浓度范围为10叫～10叫"g/mL，检出限为O.1ng/mL。Beasley等[M。]报道了快速测定仓储作物中的有机磷、杀螟松及乙基虫螨磷类农药的方法，将谷物中的农药萃取到甲醇液中，酶标组分滴加至含有缓冲液的试管中，经短暂的培养后，加入酶作用的基质。酸化后颜色稳定，结果可直接用肉眼或光度计测定。由于浓度不同，颜色处于灰白至暗绿之问，可根据颜色的深浅与浓度对数的关系(使用农药标准液) 来定量估计农药的残留水平。对杀螟松来说，检出限为4扯g/mL(在谷物中0.1mg/kg)，定量估值范围为o.5～15mg/kg(谷物)，乙基虫螨磷的检出限为1/*g/mL(在谷物中O.03mg/kg)，定量估值范围为O.1～15：mg/kg。该法可用来分离测定在谷物中处于自由态的农药(残留低于0.1mg/kg)。Roberto[¨。]等报道了对比传统免疫分析法RIA，ELIsA及生物传感器在农药残留检测与监控中的应用。文献报道可用EIA分析的农药有66多种，其中除草剂和杀虫剂较多，杀菌剂较少。近几年，虽然开发了一些农药新品种，但不是很多，而在改进 EIA的使用技术，如由多抗转向单抗、纯化抗体和抗原、改进抗体的载体和反应环境以及定量分析等方面都取得了不少成就。

　　(2)酶放大免疫测试法(EMIT) 酶放大免疫测试法是一种经典的均质酶免疫测试技术，基本原理是用特定的酶标记待测农药，然后将抗体、酶标记农药、待测农药同时加入反应试管中进行竞争反应，酶标记的待测农药与抗体结合后，酶被抑制而失去活性，样本中待测农药越多，则游离的未被抑制的酶也越多，根据吸附反应后酶活性的改变可以测定出农药的含量。该法的缺点就是每一种待测农药都必须进行酶标记，限制了该法的推广应用等报道了利用酶放大免疫技术测定拟除虫菊酯杀虫剂及衍生物，以细菌的淀粉酶为标记，检测时间不超过45min，检测限达到2～5ng/mL。