用"OD600"测定微生物生长曲线

1.OD₆₀₀应用于哪些实验？

2.微生物的不同生长时期

3.用OD₆₀₀监测微生物生长曲线的原理

4.用OD₆₀₀监测微生物生长曲线所需注意事项

5.OD₆₀₀检测的应用前景

6.监测微生物生长曲线的可替代方案

7.基于BMG酶标仪的微生物学研究

8.参考文献

OD₆₀₀可提供相关信息，反映细菌或酵母等微生物的生长状况。更具体来说，微生物生长状况与种群中微生物的数量有关，也可反映其如何随时间的变化而变化。反映微生物生长状况的信息可应用在各种生物和医学研究领域：

>抗生素耐药性：当前，针对多重耐药致病菌的感染人数和因感染而死亡的人数都在不断增加。为了控制这些致病菌，亟须不断开发新的药物或者治疗方法。在新抗菌体系研发过程中，通过测定OD₆₀₀评估抗生素对微生物生长的抑制效果，进而判断该抗菌体系的效价。

>微生物发酵生产：微生物本身可以说是工业产品，例如用于生产烘焙食品或奶酪。然而，微生物同时也可用于工业生产，例如发酵生产酶、抗生素、维生素等工业产品。微生物的这两种用途都需要包括生长特性在内的初始菌种条件优化。一旦建立了菌株及其生物发酵制程，相应的发酵生产过程就需要实时监测起来。同样，这些监测包含通过监测OD₆₀₀的变化来监测发酵生产所处的阶段。

>合成生物学：合成生物学是一门新兴的前沿热门学科，它利用基因工程学的经典方法来构建特定属性的生物系统。这也意味着需要对生物合成“机器”进行合理设计，包括对遗传机制的高度修饰，甚至修饰合成整个人工基因组。通过这些基因修饰构建出的基因工程菌可以生产一些石化产品的替代品，如生物燃料或塑料，以及可以检测污染物或降解塑料的微生物制品。合成生物学的这些大部分工作是在大肠杆菌或酿酒酵母等微生物中进行的。同样，整个生物发酵过程需要实时测定OD₆₀₀来监测相关微生物的生长情况。

监测微生物种群随时间的生长变化可以得到一条相应的生长特性曲线（如图1），该曲线由四个阶段组成：

图1，微生物生长曲线完整周期示意图

迟缓期（Lag Phase）：在培养基中接种少量微生物开始培养后，微生物需要适应新的环境，这个阶段没有细胞分裂，同样生物量也保持不变。

对数期（Log Phase）：微生物一旦适应了新的环境就开始复制生长。每个细胞在特定的时间复制，进而出现细胞数量快速指数式增长。对数生长期生长速率最快，因此可进一步用于计算倍增时间、生长速率等参数。

稳定期（Stationary Phase）：微生物的生长受到培养基中营养物质的限制。一旦碳源或其他关键营养物质用完，微生物就会停止生长。这一阶段的生长曲线反映的是微生物高生物量的稳定时期。

衰亡期（Death Phase）：由于缺乏营养物质、盐、氨基酸，以及有害物质如酸或乙醇的增加，微生物生长环境变得恶劣起来，微生物也随之开始死亡，反映在生长曲线上就是微生物生物量变得整体下降。

监测微生物生长曲线最常用的方法为测定600nm波长下的光密度，即OD₆₀₀吸光度。该方法基于吸光度检测模式，主要检测穿过样本的那部分光，具体来说就是穿过微生物悬液的那部分光。那么透射光与微生物的生长过程又有什么关系呢？由于溶液中的颗粒本身会产生散射光，并且溶液中的颗粒越多，相应的散射光就越强，因此，微生物悬液中随着细菌或酵母细胞数量的成倍增加，相应的散射光和所测定的吸光度值也就随之增加。这也意味着，利用吸光度模式检测微生物细胞数量，其吸光度测定值仅仅是用来反映溶液中微生物的散射光光强度，而不是反映对光有吸收的物质对光的物理吸收特性。这一点很重要：OD₆₀₀数值所反映的结果其实不是微生物样品的吸光度，而是微生物样品颗粒的散射光强度。

如上所述，由于OD₆₀₀检测的是散射光而不是吸收光，并且吸收光常用的比尔定律描述的是吸光度值与对光有吸收的物质浓度线性关系， 因此比尔定律在理论上并不适用于微生物OD₆₀₀的检测。然而实践表明，尽管微生物OD₆₀₀的检测没有光吸收信息，比尔定律仍然适用于低密度微生物。换句话来说，对于低密度微生物悬液，OD₆₀₀值可以跟微生物细胞数量有直接的换算关系。对于高密度微生物悬液，OD₆₀₀的测定数据则更像是抛物线形式的。如果想要用OD₆₀₀的值来反映高密度微生物悬液样品浓度，那么针对不同的微生物，OD₆₀₀的值和相应的细胞数量都需要做相应的换算校正¹。

比色皿还是微孔板？

在对大容量的生物制程进行监测过程中，一般推荐使用比色皿。这种监测，通常需要每隔一定时间（如1小时），测定微生物的生长状况。每次检测需要大约1.5ml微生物悬液，并且检测之前需要一定时间进行样品抽取（如图2）。

图2，酵母培养发酵罐样品抽提

微孔板则主要用于长时间连续监测微生物生长状况。检测过程中，每孔只需200微升悬液，设定相应检测间隔时间，仪器便可自动实时监测微生物生长状况。因为通常所用的微孔板为96孔板，所以这种检测方法非常适合于不同培养基条件或者不同菌株的多样品重复长时间自动监测。

哪些仪器可用？

利用用吸光度功能测定颗粒的散射光，使用不同仪器会有不同结果。原因是不同的仪器使用不同的光束，并且探测器的位置到样品的距离也不同。对于微生物悬液产生的散射光，由于距离样品不同距离的检测器，其收集的散射光信号不同，例如，距离近的检测器可以检测到散射光，距离远的检测器则可能检测不到散射光（如图3）。因此，推荐使用可用OD₆₀₀来监测微生物生长过程的专用仪器来做此类检测。显然，如果要用比色皿或者微孔板来检测，我们只能选择分光光度计或酶标仪。而可以同时使用比色皿和微孔板来检测的设备，例如BMG SPECTROstar Nano，对于此类应用会是一种更好的选择，可以满足未来所有的实验需求。

图3，不同的设备会有不同检测结果。相同大小的检测器，越靠近微生物样品，越能检测到相应的散射光信号，距离太远的检测器，则检测不到散射光信号

什么时候需要校准？

如果要用OD₆₀₀来确定溶液中微生物的细胞数量或浓度（细胞数/ml），或者校正OD₆₀₀散射光测定的非线性问题，那么需要对此方法进行校准。校准过程中，需要先制备已知微生物浓度的微生物悬液，然后在所用仪器上使用与后续实验相同的体积来测定OD₆₀₀，最后可使用这些测量值制作校准曲线。之后，便可通过未知样本的OD₆₀₀值，根据校准曲线来测算微生物样品浓度。由于散射光强度会随颗粒大小或形状而改变，所以针对不同的微生物，推荐测定相应的校准曲线来测算微生物样品浓度。同样，当更换分析仪器或者样品体积时，散射光和样品浓度对应的校准曲线也是需要重新测定的。

在微孔板中用OD₆₀₀测定微生物生长曲线的方法，正在越来越多地与荧光或发光等检测模式结合起来。微生物生长曲线的测定也可作为另一种检测指标的归一化内参来使用。例如发表在Nucleic Acids Research杂志上的一篇文章，作者使用CLARIOstar多功能酶标仪检测金黄色葡萄球菌的蛋白翻译过程²。该文章采用荧光模式检测半乳糖苷酶活性，而反映该酶活性的荧光信号，则通过同时检测OD₆₀₀来做归一化处理。另外一篇文章使用发光模式检测单核细胞增多症李氏菌的基因表达，其中反映基因表达情况的化学发光信号，同样是通过同时检测OD₆₀₀来做归一化处理³。这些检测模式的结合应用，为基于微生物单细胞层面的基因转录或者蛋白表达定量分析提供了更好的解决方案。

浊度法

浊度法测定微生物的生长曲线也是基于检测微生物悬液散射光的原理。与OD₆₀₀测定（OD₆₀₀测定的是微生物的散射光，所以OD₆₀₀在这个应用里收集的不是透射光）不同的是，浊度法只是直接检测微生物的散射光。BMG LABTECH公司应用手册中，Nephelometric monitoring growth of Candida albicans using BMG LABTECH’s NEPHELOstar® Plus这篇应用介绍了如