有关细胞生长状况指标的检测方法
摘要： 细胞计数这是细胞培养中常用的基本技术之一,所用材料为细胞计数板、巴氏吸管和显微镜,步骤如下.
一、细胞计数
这是细胞培养中常用的基本技术之一.所用材料为细胞计数板.巴氏吸管和显微镜.步骤如下.
取清洁计数板和专用盖玻片,用丝绸布轻轻擦干.
取细胞悬液0.3ml,加入0.9结晶紫染液,混匀后滴半滴于细胞计数板内,以充满不外溢为宜.也可直接将细胞悬液在一侧滴加到盖玻片中,不要溢出,也不要过少或出现气泡.
在显微镜下用10X物镜观察计数四角大方格中的细胞数.代入下式得出细胞密度.
细胞数(ml)=(4大格细胞数之和/4)×104×稀释倍数
台盼蓝染色法可计算出活细胞和死细胞数以测定细胞存活百分率.一般0.5%-1.0%的台盼蓝染液可使死细胞染成蓝色,活细胞不着色.此外还可用0.02%的藻红b染液将死细胞或受损细胞染成红色,或用0.05%的苯胺黑染液将死细胞染成黑丝.
细胞存活率=[4大格活细胞数/(4大格活细胞数+4大格死细胞数)]×100%
在进行细胞计数操作时,必须把细胞悬液准备好,细胞应分散良好,并充分混匀,若出现较多细胞团或细胞数少于200个/10mm2或多于500个/100mm2时,需重制细胞悬液,重新计数.
二、细胞生长曲线和生长倍数
细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标,是测定细胞绝对增值数值和生长繁殖基本规律常用的简便方法.常用的方法为：在同一规格的培养瓶中,接种等量的同一代细胞,经培养后每隔24h取出几瓶细胞进行计数,以培养时间为横坐标,不同时刻的细胞数的对数为纵坐标,标出各点并连成线,即为该细胞的生长曲线,可反映出细胞生长的动态.
测定生长曲线的另一种方法是用96孔/24孔细胞培养板,分7组,每组3孔,培养1周(7天),期间逐日检测一组,计数,最后把7天中的细胞数值绘成图,即为细胞生长曲线.
也可采用MTT法来进行生长曲线测定.
标准的细胞生长曲线近似“S”形,一般在传代后第一天细胞数有所减少,经过一段时间的潜伏期,再进入对数生长期,达到平台期后生长稳定,最后衰老.
细胞生长倍数是指测定接种时活细胞的浓度,经1个生长周期达到最大活细胞浓度比例.
生长倍数=培养后最大活细胞数浓度/接种时的活细胞浓度
三、细胞分裂指数
细胞分裂指数是表示细胞增殖旺盛程度的指标.它以被测的1000个细胞中的分裂细胞数来计算.其方法为：用秋水仙素将细胞处理1-2h后,玩染色制片法制片并染色,计算1000个细胞中分裂象的数目,重复4次取平均值,用百分比表示.
细胞准备.用支持物盖片培养法.
每24h取出一个小盖片,按常规方法进行固定,吉姆萨染色或HE染色,封片,制成永久标本.
显微镜下选择细胞密度适中的区域观察分裂细胞并计数.逐个视野进行,对每一时间组的盖片各取细胞多、中、少的区域各一个,共计算1000个细胞,计算出平均分裂细胞所占百分比.观察时要掌握好分裂象标准,主要是确定好划分间期和前期,末期和间期等的界限,以减少误差.
细胞分裂指数=分裂细胞数/细胞总数(1000)×1000
四、细胞接种存活率
细胞接种存活率又称细胞贴壁率.它是下拨被制成分散的悬液后,以低浓度(2-5个/cm2)接种到底物上,贴壁并能存活生长形成细胞小群(克隆)的细胞百分数值,用以表示细胞的生存能力和细胞群的活力.
取对数生长期细胞,用消化法制成细胞悬液,计数后按检测细胞生长曲线接种细胞的原则,将细胞接种于培养瓶中,接种12-15瓶.
每2h取出一瓶,倒掉培养科,然后加入胰酶消化已贴壁细胞,计数已贴壁细胞,用下面的公式逐个计算每个时间上的贴壁率.每2h一次,共观察24h即12次.
接种存活率(贴壁率)=(贴壁村活细胞数/接种细胞数)X 100%
五、克隆形成率
细胞接种存活率只表示接种细胞后贴壁的细胞数,但贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆.而形成克隆的细胞必为贴壁和有增值活力的细胞.克隆形成率反映细胞群体依赖性和增值能力两个重要性状,由于细胞生物学性状不同,细胞克隆形成率差别也很大,一般初代培养细胞克隆形成率低,传代细胞系高;二倍体细胞克隆形成率低,转化细胞系高;正常细胞克隆形成率低,肿瘤细胞高.并且克隆形成率与接种密度有一定关系,做克隆形成率测定时,接种细胞一定要分散成单细胞悬液,直接接种在皿中,持续1周,随时检查,到细胞形成克隆时终止培养.
1、平板克隆形成试验
取对数生长期的单层培养细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞,把细胞悬浮在含10%胎牛血清的RPMI培养基中备用.
将细胞悬液做梯度倍数稀释,以适当的细胞浓度接种于培养皿中.一般按每皿50个、100个、200个细胞的梯度密度接种于含10ml
37℃预温培养基的皿中,并轻转动,使细胞分散均匀.置于37℃、5%CO2及饱和湿度的环境下,静置培养2-3周.
经常观察,当培养皿中出现肉眼可见的克隆时,终止培养,弃去上清,用PBS小心浸洗2次.加纯甲醇或醋酸/甲醇(1：3)5ml,固定15min.然后去固定液,加适量吉姆萨应用染液染10-30min,然后用流水缓慢洗去染液,空气干燥.
将培养皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片,用肉眼直接计数克隆,或在显微镜下计数大于10个细胞的克隆.最后计算克隆形成率.
克隆形成率=(克隆数/接种细胞)×100%
平板克隆形成试验方法简单,适用于贴壁生长的细胞.适宜底物为玻璃的、塑料的瓶.试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度.细胞一定要分散得好,不能有细胞团,接种密度不能过大.
2、软琼脂培养克隆形成试验
取对数生长期细胞,用0.25%胰蛋白酶消化并轻轻吹打,使之成为单细胞,作活细胞计数,用含20%胎牛血清的DMEM培养基调整细胞密度至1X10^6个
/L.然后根据试验要求做梯度倍数稀释. 用蒸馏水分别制备出1.2%和0.7%两个浓度的低熔点软琼脂,高压灭菌后,维持在40℃中不会凝固.
按1：1比例让1.2%的琼脂糖液和2XDMEM培养基混合后,取3ml混合液注入直径6cm平皿中,冷却凝固作为底层琼脂,置CO2恒温箱中备用.
按1：1比例让0.7%琼脂糖液和2XDMEM培养基在无菌试管中相混以后,再向管中加入0.2ml细胞悬液,充分混匀,注入铺有1.2%琼脂糖底层的平皿中,逐渐形成双琼脂层.待上层琼脂凝固后,置入37℃、5%CO2恒温箱中培养10-14天.
把平皿放置在倒置显微镜下,观察细胞克隆数,计算克隆形成率.
软琼脂培养法常用来检测肿瘤细胞系和转化细胞系.试验中琼脂与细胞相混时,琼脂温度不宜超过40℃.接种细胞密度每平方厘米不超过35个,一般6cm平皿接种1000个细胞.正常细胞在悬浮状态下不能增殖,不适用于软琼脂克隆形成试验.
