二硫键定位分析步骤

蛋白理论分子量为M1，有n个半胱氨酸（Cys）

Step 1 直接使用质谱测定该蛋白质的分子量，得到MW－2x；然后用DTT将全部

       二硫键打开得到M1，则   x即为该蛋白含有的二硫键的个数。

Step 2 将该蛋白利用4－VP处理得到分子量MW＋105y，y即为该蛋白含有的游离

       巯基的个数，则x＋y＝n

Step 3 将该蛋白利用合适的酶进行酶切（trypsin，chymotrypsin...），液质联用

       分析或MALDI－TOF MS 分析得到肽谱，计算理论上出现的肽段以及实际得

       到的多肽片段。

Step 4 将酶解得到的多肽混合物用DTT将全部二硫键打开，联用分析，与3得到的

       肽断混合物比对，计算出现的新肽断，则二硫键位于新出现的肽断之间。

       如 DTT处理后的多肽混合物中检测出多肽P1和P2， Step 3中未检测出这两

       个多肽，但检测出质荷比m/z = P1＋P2－3的多肽，这P1和P2之间存在二

       硫键；

Step 5 如果一个肽段上有两个cys，则需要先利用4－vp处理蛋白，然后酶解，DTT

       还原，将目标肽断进行MS3分析，即得到同一肽段上那个Cys以二硫键的

       形式存在；

Step 6  如果两个disulfide交叉，则需要利用分部还原，多用TCEP。

Step 7  常用还原二硫键的试剂DTT，TCEP， 常用衍生Cys上的巯基的试剂有4－

              vp等。