慢病毒载体研究

一、慢病毒

逆转录病毒（Retrovirus）：是一种RNA病毒，在复制时需在逆转录酶的作用下首先将RNA转变为cDNA， 再在DNA复制、转录、翻译等蛋白酶作用下扩增。主要包括RNA肿瘤病毒、慢病毒及泡沫病毒等三种亚科。

慢病毒（Lentivirus）：属于逆转录病毒科，名称源自该种病毒长达数年的潜伏期。

最经典的慢病毒是由HIV病毒改造而来，而且HIV-1/HIV-2系统也得到了广泛的应用，除了HIV病毒系统以外，后续还有猿类免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus, SIV）载体系统、猫免疫缺陷病毒（felines immunodeficiency virus, FIV）载体系统、绵羊梅迪-维斯纳病毒（MMV）载体系统和马传染性贫血(EIA）载体系统等。

慢病毒结构：

2个调节基因：

（1）tat基因：反式激活因子，对HIV基因起正调控作用。

（2）rev基因：病毒蛋白表达调节因子，增加gag和env基因对结构蛋白的表达。

4个辅助蛋白（附属）基因：

（1）vif和vpu调节感染性病毒颗粒的产生；

（2）vpr和nef参与疾病的表现。

慢病毒的优势：

1.慢病毒携带的基因组可整合到宿主基因组，使宿主细胞长时间稳定表达外源基因；

2.可感染分裂和非分裂细胞；

3.低免疫原性，直接注射活体组织不易造成免疫反应，适用于动物实验；

4.可以更换特异性启动子；

5.野生型的HIV大小约为9.8 kb，插入片段可长达5-6 kb；

二、慢病毒载体

慢病毒载体（Lentivirus）是一类改造自人免疫缺陷病毒（HIV）的病毒载体，是逆转录病毒的一种，基因组是RNA，其毒性基因已经被剔除并被外源性目的基因所取代，属于假型病毒。可利用逆转录酶将外源基因整合到基因组中实现稳定表达，具有感染分裂期与非分裂期细胞的特性。

慢病毒包装过程：

慢病毒基因组进入细胞后，在细胞浆中反转录为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录成mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生小RNA。慢病毒介导的基因表达或小RNA干扰作用持续且稳定，并随细胞基因组的分裂而分裂。

慢病毒包装和侵染细胞的过程（元和生物）

三、慢病毒的使用和优势

慢病毒的使用量的取决因素：滴度， 感染体积 ，MOI ，细胞密度

滴度（Titer）：单位体积液体中有感染能力的病毒或噬菌体数目。单位：TU/mL （活性滴度单位）、copies/mL （物理滴度单位）

检测方法：定量PCR检测干扰后细胞基因组中外源DNA拷贝数。

实验原理：慢病毒介导外源基因以逆转录方式整合进目的细胞基因组。

MOI（multiplicity of infection）：感染复数或者复感染指数。指感染时病毒和细胞数量的比值。在实验中也将某个细胞达到 80%感染时所需的MOI 值定义为这个细胞的MOI值。加的病毒量(μl)=细胞数×MOI/滴度(…/ml) ×1000。

最后，818 一些有关慢病毒方面的产品：

1.关于慢病毒载体构建方面：

ORF表达克隆产品【LPP-货号-载体-100，ORF/Promoter/lncRNA慢病毒】

shRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，shRNA慢病毒】

miRNA克隆产品【LPP-货号-载体-050，miRNA/inhibitor慢病毒】

Cas 9 和sgRNA克隆产品【LPP-CP-LvC9NU-载体-100，Cas9 慢病毒】

2.慢病毒包装服务方面（慢病毒颗粒，病毒浓缩，包装细胞系等）

LT001，基于HIV骨架的慢病毒颗粒包装试剂 (20 reactions)

LT005，基于qRT-PCR技术的HIV骨架慢病毒颗粒滴度检测试剂 （20次RT反应 +50次PCR反应）

LT007，慢病毒浓缩试剂盒（50 ml）

LT008，293Ta慢病毒颗粒包装细胞系 (1.5 x 106 cells)