Bradford法总蛋白含量测试试剂盒测定原理与方法

Bradford法总蛋白含量测试试剂盒

（C003-100T 分光光度计法）

一、测定原理

在酸性溶液中，考马斯亮蓝G250（Coomassie brilliant blue G250）染料主要与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸和赖氨酸）和芳香族氨基酸的残基通过疏水力相结合，从而使染料的最大吸收峰由波长465nm变为波长595nm，溶液的颜色由棕红色变为蓝色。在一定蛋白浓度范围内，溶液在波长595nm处的吸光度与蛋白质浓度呈线性关系。根据标准蛋白溶液绘制标准曲线，就可通过测定样品在波长595nm的吸光度计算样品的蛋白质浓度；然后根据公式计算生物样品的可溶性蛋白质含量。

二、试剂组成

试剂一：显色液 200ml×2瓶

试剂二：2.5mg/ml结晶牛血清蛋白（BSA）标准品，0.5ml×1瓶

三、储存条件及有效期

试剂一：4℃避光保存；试剂二-20℃保存。可保存12个月。

四、试剂的配制

标准品的配制：在试剂二瓶中加入4.5mL双蒸水，充分混匀，得到5ml浓度为250μg/ml的标准蛋白溶液。分别移取0，100，200，300，400，600，800，1000μL于空试管中，加入1000，900，800，700，600，400，200，0μL双蒸水，得到0，25，50，75，100，150，200，250μg/ml的BSA标准品应用液。

五、操作步骤

六、计算方法

1. 绘制标准曲线

以标准蛋白溶液浓度0，25，50，75，100，150，200，250μg/ml为横坐标，以酶标仪测得的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线并得到方程，一般认为相关系数（R²）大于0.99可用。实测得标准曲线如下：

2. 计算样品浓度

由计算得到的方程求样品浓度。

七、注意事项

1. 染色液接触皮肤后较难清洗，请务必戴手套操作。本实验用过的比色皿及试管请在实验结束后尽快使用酒精清洗，避免比色皿被染色。

2. 本方法灵敏度高，可以测定最低至25μg/mL的蛋白质浓度，蛋白浓度过高会超出标准曲线线性范围，务必稀释后测定。推荐标曲范围0-250μg/mL，但实测0-500μg/mL浓度范围内标曲相关系数通常能够达到要求以上。具体范围请用户根据标曲制作情况判断。

3. Bradford法测定蛋白浓度不受一般浓度还原型试剂如β-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)影响；但受去垢剂影响。如样品处理时加入过SDS、Triton X-100、Tween 等试剂，建议改用其它方法如BCA法测定。

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