蛋白质的分离、纯化和表征

蛋白质也是一种两性电解质。它的酸碱性质主要决定于肽链上可解离的R基团。对某些蛋白质说，在某一pH下它所带的正电荷与负电荷相等，即净电荷为零，此pH称为蛋白质的等电点。各种蛋白质都有自己特定的等电点。在等电点以上的pH时蛋白质分子带净负电荷，在等电点以下的pH时带净正电荷。蛋白质处于等电点时溶解度最小。在无盐类干扰情况下，一种蛋白质的质子供体基团解离出来的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH是它的真正等电点，称为等离子点，它是该蛋白质的特征常数。（蛋白质标准物质）

测定蛋白质相对分子质量（M_r）的最重要的方法是利用超速离心机的沉降速度法和沉降平衡法。沉降系数（s）的定义是单位离心场强度的沉降速度。s也常用来近似地描述生物大分子的大小。凝胶过滤是一种简便的测定蛋白质M_r的方法。SDS-聚丙乙酰胺凝胶电泳（PAEG）用于测定单体蛋白质或亚基的M_r。

蛋白质溶液是亲水胶体系统。蛋白质分子颗粒（直径1～100nm）是系统的分散相，水是分散介质。蛋白质分子颗粒周围的双电层和水化层是稳定蛋白质胶体系统的主要因素。

分离蛋白质混合物的各种方法主要根据蛋白质在溶液中的下列性质：（1）分子大小；（2）溶解度；（3）电荷；（4）吸附性质；（5）对配体分子特异的生物学亲和力。透析和超过滤是利用蛋白质不能通过半透膜的性质使蛋白质分子和小分子分开，常用于浓缩和脱盐。密度梯度离心和凝胶过滤层析都已成功地用于分离蛋白质混合物。等电点沉淀、盐析和有机溶剂分级分离等方法常用于蛋白质分离的头几步。移动界面电泳、各种形式的区带电泳，特别是圆盘凝胶电泳、毛细血管电泳以及等电聚焦具有很高的分辨率。纤维素离子交换剂和Sephadex离子交换剂的离子交换柱层析已广泛地用于蛋白质的分离纯化。HPLC和亲和层析法是十分有效的分离纯化方法。

蛋白质制品的纯度鉴定通常采用分辨率高的物理化学方法，例如PAGE、等电聚焦、毛细血管电泳、沉降分析和HPLC等。如果制品是纯的，在这些分析的图谱上只呈现一个峰或一条带。必须指出，任何单独鉴定只能认为是蛋白质分子均医性的必要条件而不是充分条件。