荧光定量PCR研究——ROX染料是什么作用？

上一篇 / 下一篇 2021-07-01 17:05:19/ 个人分类：荧光定量

前言：荧光定量PCR是1996年由美国Applied Biosystems 公司推出的。经过二十年的发展，该技术已经被广泛应用于临床疾病诊断各种传染病诊断和疗效评价；临床疾病诊断动物疾病检测；食源微生物、食品过敏源、转基因研究等食品安全操作等等各个领域。

1、基因分型

例如SNP检测，甲基化检测等。

SNP检测是确定一对染色体的每种基因的两个拷贝，哪种点突变在这两个拷贝中存在，因此利用荧光定量PCR方法，并配合芯片技术可以快速灵敏的检测到SNP结果。

DNA甲基化是Z早发现的基因表观修饰方式之一，真核生物中的甲基化仅发生于胞嘧啶，即在DNA甲基化转移酶（DNMTs）的作用下使CpG二核苷酸5’-端的胞嘧啶转变为5’-甲基胞嘧啶。DNA甲基化通常抑制基因表达，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。

2、基因表达差异分析

例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等 )，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA 芯片或差显结果的确证。

基因表达差异通常是指一个基因在两个条件中表达水平的检测值在排除实验、检测等因素外，达到一定的差异，具有统计学意义，同时也具有生物学意义。

3、DNA 或RNA 的定量分析

包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等。基因失活是指利用反义技术，使非正常基因或有害基因不表达或降低表达活性，以达到治疗某些特定疾病的目的。

实时荧光定量PCR（quantitative PCR, qPCR）通过对PCR扩增反应中的每一个循环产物荧光信号的实时监测从而实现对起始模板的定性及定量分析。

实时荧光定量PCR系统知识汇总

1.在qPCR 技术中重要的参数指标有哪些？

扩增及溶解曲线：扩增曲线是PCR过程中，以循环数为横坐标，以荧光强度为纵坐标所绘制的曲线。主要用于反映qPCR的动态进程；溶解曲线是用来验证扩增产物特异性的，如果产物是单一条带，溶解曲线就会出现单峰，如果有引物二聚体或其它非特异性扩增，就会出现至少两个峰。

荧光域值（threshold）: 是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值的缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光信号标准偏差的10倍，即：threshold。

Ct 值：是指每个反应管内的荧光信号到达设定域值时所经历的循环数。将已知浓度的标准品梯度稀释进行qPCR，按照起始DNA量由多到少的顺序等间隔得到一系列扩增曲线。Ct值与起始模板数的对数值之间存在线性关系，可以制作标准曲线。未知浓度的样品也得到Ct值，代入标准曲线，就可以求出未知样品的起始模板量。

2.扩增曲线一般分为哪几个阶段

荧光扩增曲线一般分为基线期、指数增长期和平台期。在qPCR扩增早期，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化，此时即为基线期，

PCR反应过程中产生的DNA拷贝数是呈指数形式增加的，随着反应循环数的增加，zui终PCR反应不再以指数形式生成模板，从而进入平台期，在该时期，扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系，只有在荧光信号的指数增长期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

3.ROX染料是什么作用？

ROX（Passive Reference Dye）是一种惰性参比染料，在qPCR反应中能被qPCR仪检测到。ROX不参与qPCR反应，荧光信号值不会随着qPCR扩增而改变。实验过程中很多因素会引起孔间差异：不均匀的照明，孔与孔之间光学因素（液滴、气泡）的因素，反应体系的浓度不同…… 可以用ROX作为阳性参比，对其他荧光信号进行归一化校正，以提高数据的较精确度。

4.Ct值多少才算理想

一般来说Ct值在30以下都可以说实验结果是可靠的，30以上基本可以说明该基因没有扩增，但也不是的，需要辅以溶解曲线加以解释。

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