核仁素的蛋白质2RNA 杂交体系诱饵载体的构建及表达

[摘要]【目的】将核仁素开放阅读框构建到Hybrid Hunter 蛋白质2RNA 杂交系统p YESTrp3“饵”载体,明确其在酵母细胞中的表达,排除自身激活作用,验证其能否用于蛋白质2RNA 杂交体系筛选cDNA 文库。【方法】设计引物,从真核表达载体pEGFP2N12C23 上,扩增出C23 开放阅读框,经EcoR Ⅰ和Not Ⅰ双酶切后,克隆到蛋白质2RNA 杂交的“饵”载体p YESTrp3 质粒上,构建成载体p YESTrp32C23 。阳性克隆经EcoRⅠ和Not Ⅰ双酶切鉴定后,转入酵母中,用酵母蛋白抽提物作Western 杂交,证实其表达;滤膜印记杂交验证其有无自身激活作用。【结果】所构建的载体pYESTrp32C23 双酶切后,片段大小正确;转入酵母菌L402ura3/ p HybLex/ Zeo2MS2 后,提取酵母质粒, PCR 扩增出预期大小的片段,Western 杂交出现阳性条带;滤膜杂交,转有p YESTrp32C23 和阴性对照p YESTrp3 的酵母菌落没有激活报告基因,而GAL4 全长的阳性对照菌落变为蓝色。【结论】含有C23 的“饵”载体构建正确,在酵母细胞中能表达出C23 蛋白,并且没有自身激活报告基因的功能,能够应用于蛋白质2RNA 杂交体系。