家蚕滞育生物钟蛋白质EA4基因的cDNA克隆和序列分析

摘　要　家蚕滞育生物钟是依赖卵内酯酶A4 ( EA4)的倒计时型生物钟。EA4是具时间间隔测定酶( time intervalmeasuring enzyme, TIME)功能的蛋白质。根据家蚕EA4测定的氨基酸序列,以第3天龄雌蛹脂肪体和卵巢总RNA为模板,利用简并引物RT2PCR方法,得到308 bp的部分ea4序列,其1 - 144 nt和145 - 308 nt分别与家蚕全基因组鸟枪序列(whole genome shotgun sequence,WGS) AADK0101912611的5 595 - 5 738 nt及WGS AADK0101446711的8 636 - 8 473 nt有95%和98%的一致性。根据获得的ea4基因片段序列,利用生物信息学方法和家蚕基因组数据预测了ea4基因的完整cDNA序列,设计特异引物,以雌蛹脂肪体和卵巢RNA为模板,进行RT2PCR得到完整的cDNA。ea4基因的cDNA全长519 bp,其中1 - 48 bp为信号肽序列, 49 - 519 bp编码的氨基酸与蛋白质纯化后测序EA4部分的一致性为98% , C末端存在3个氨基酸的差异,其中第156位为新确定氨基酸。