奶粉中双氰胺的检测方法（HPLC-UV和HPLC-MS/MS法）

上一篇 / 下一篇 2013-01-28 00:23:19

北京时间1月25日凌晨消息，新西兰牛奶中发现了有害物质——双氰胺。双氰胺又名二氰二胺，缩写DICY或DCD。虽然国际标准未对食品中的双氰胺限量，但高剂量的双氰胺对人体是有毒的。
本文采用天津博纳艾杰尔科技的Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管（货号：MS-DI5001）和Venusil^® HILIC液相色谱柱，建立了奶粉中双氰胺的MAS-QuEChERS快速前处理方法和LC-UV以及LC-MS/MS检测方法。

实验部分
1qK9mO;U0Q(Wua0仪器和试剂分析测试百科网4N0\mp1X f
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
F,|8?A/Q7z8A0双氰胺标准品，Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil^® HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。分析测试百科网!n!T,K8}O.?
实验方法分析测试百科网(]Q U"X0ff{
提取、净化
aL@3Vq cDP@._0称取1g试样于50ml具塞离心管中，加入2ml水溶解后，加乙腈定容至10ml，超声10min，8000r/min离心5min，取2ml上清液加Cleanert^® MAS-QuChERS-双氰胺净化管中，，涡旋0.5min，8000r/min离心5min，取上清液过0.22um滤膜，待测。
b_iZ2P/k0分析测试百科网(OQ1y]L'W$q
HPLC法：
,C-rX5l t QEr0
,{r?*f}@|(H,c0色谱条件：
-iM/D0m{0色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 4.6*250mm；
)b!Ga5A"wM7Yz.t o0流动相：A：10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）；分析测试百科网1a A&~%Eqdf0iP
B：乙腈；分析测试百科网"esD;M3`e
A：B=10:90；分析测试百科网h%|7gUZa*DxR
检测波长：220nm；
N3gok(I O)I(p0进样量：10µl；
b:LJ~3]4Ma0柱温：30℃；
)d d(R;P5G.TeZ0流速：1ml/min。分析测试百科网/s%LT8]w?\

i#AJ#\5P.W0实验结果：
线性关系和检出限
Ii-{3ZP&dZ8o/c0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；分析测试百科网yC;z_jDT2xR
分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为0.1µg/ml，0.5µg/ml，1.0µg/ml，2.0µg/ml，5.0µg/ml和10.0µg/ml的标准溶液，按照上述色谱条件，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表2：

表2 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	4.92min	Y=116.44X+3.2699	0.9997	0.1µg/ml

eU:kTD0检测方法稳定性考察
#zX\Ur&lS0选用10.0µg/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表3：

表3 检测方法定性和定量稳定性考察考察（HPLC法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	4.930	1061.7
2	4.933	1072.2
3	4.930	1064.4
4	4.929	1079.7
5	4.930	1067.3
6	4.934	1073.6
RSD，%	0.04	0.62

q;n5G5? V"M0准确度和精密度
$kJ#ei4z&Y]-B(F0选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表4

表4 10µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
98.6	88.4	89.8	92.3	5.99

分析测试百科网wj!i#` L~A
LC-MS/MS法：分析测试百科网/g)a)Zw]
分析测试百科网!Y5R2f2X k
色谱条件：分析测试百科网 C:p0T!o{ XO9Nf
色谱柱：Venusil^® HILIC 5μm 100Å 2.1*150mm；分析测试百科网f T)l/ZCl;T0a
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
~;E @_J'y?,A:I0B：乙腈
A：B=10:90
4ptYW7z,YRFO0进样量：10µl；
a:B,x\qaZ9x7j0柱温：30℃；
d M*d"A c U7o6M*rn F0流速：0.2 ml/min。分析测试百科网v2H&uK|v

!wg#J+_K Dq&m)|hp1bY0质谱条件
{y1eXEs DH3q0质谱仪：API 4000+；
%xO-T.y(w(~0离子源：电喷雾离子源；
{$s#O$eW6Y/q0扫描方式：正离子扫描；
+~ K-kOlO0检测方式：多反应监测；
CAD：8.00；分析测试百科网;n#r6l*G1d;dh{
CUR：10.00；分析测试百科网a!d:s](aH
GS1：60.00；分析测试百科网/l2j+[)a{4`;mOP
GS2：50.00；
h GFW)S5[8h(Z8Y/Vc0IS：5500.00；分析测试百科网2Efql0G_
TEM：500.00。

表5 双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85/68	71	10	41	6
	85/43	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

实验结果
H(Go6z'H0线性关系和检出限
x:L1lT I(gn?0准确称取双氰胺标准品50mg于50ml容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
9XM^:H wXpk0分别量取一定量的标准贮备液，用乙腈稀释，配置成浓度为5ng/ml，10ng/ml，20ng/ml，50ng/ml，100ng/ml和500ng/ml的标准溶液，按照上述液质方法，依次进样检测。以标准溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见下表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	3.15min	Y=8777.2X+7435.9	0.9993	5ng/ml

检测方法稳定性考察
v%bP)s]#_1]*F0选用50.0ng/ml的标准溶液连续进样6针，计算其保留时间和峰面积的RSD值，结果见表7：

表7 检测方法定性和定量稳定性考察考察（LC-MS/MS法）

标号	保留时间，min	峰面积
1	3.29	382950
2	3.30	387950
3	3.25	382840
4	3.31	399820
5	3.30	378580
6	3.30	383810
RSD，%	0.65	1.92

分析测试百科网?4`;V{k%|X
准确度和精密度分析测试百科网6W:g:q2]]
选取市售某品牌奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表8。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表8 100ng/g添加回收实验结果

平行1，%	平行2，%	平行3，%	平均值，%	RSD，%
84.6	80.7	90.2	85.2	5.61

双氰胺检测方法包订货信息

产品名称	规格型号	货号
MAS-QuChERS-双氰胺净化管	100mg/10ml，100支/包	MS-SQA01
Venusil HILIC	4.6*250mm，5μm，100Å	VH952505-0
Venusil HILIC	2.1*150mm，5μm，100Å	VH951502-0
微孔滤膜	0.22μm，直径13mm,200/PK	AM021320
双氰胺对照品	1g/瓶，含量≥99.0%	DCD-0001
离心管	50mL，带螺纹盖，25个/包	L050025-C
一次性无菌注射器	5mL,100/pk	ZSQ-5ML

附图

NH^ik*R0图1 定性定量稳定性考察谱图（HPLC法）
3Zh+}*gf} HT k}0
X;L/k0q7BCE0图2 双氰胺0.5μg/ml标准溶液谱图（HPLC法）

'vDL]+TI2tH0图3 奶粉空白谱图（HPLC法）
9Z~2f8ji$y0
U(NVHL1T$E/?0图4 奶粉10μg/g空白谱图（HPLC法）分析测试百科网P#j-F_#\3c3~$Z9t

_}HaQ9o0图 5 10ng/ml双氰胺标准溶液质谱图
7J@ ^5a1S,y0
T"z@b/h0图 6 奶粉空白质谱图