利用XP色谱柱改进美国药典（USP）噻康唑有机杂质分析方法

利用eXtended Performance（XP）色谱柱改进美国药典（USP）噻康唑有机杂质分析方法

Kenneth D.Berthelette、Mia Summers和Kenneth J.Fountain

沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德

方案优势

■ 使用XP色谱柱改进耗时的USP美国药典有机杂质分析方法，实现更快速的分析并减少溶剂的使用量，同时仍符合美国药典<621>章指南的规定。

■ 将样品运行时间缩短80%，从而提高了生产能力。

■ 将溶剂用量减少90%，降低了运行成本。

沃特世提供的解决方案

ACQUITY UPLCH-Class系统

AllianceHPLC系统

XSelect CSH C18色谱柱

Empower3软件

eXtended Performance [XP] 2.5 μm色谱柱 TruView LCMS认证最大回收样品瓶

关键词

美国药典方法、噻康唑、ACQUITY UPLC色谱柱计算器、沃特世反相色谱柱选择表、仿制药

引言

全世界的制药企业在日常工作中都需要对仿制药中的有机杂质进行分析。使用较为陈旧的仪器和色谱柱技术进行有机杂质分析，因为需要长时间使用大量的溶 剂，所以既耗时又费钱。然而通过使用显著改进的仪器和色谱柱技术有机杂质分析会变得更高效。2.5μm 粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱设计用于高效液相色谱和超高效液相色谱。该色谱柱是改进美国药典方法的理想选择，因为其能够使色谱分析工作者实现更 小粒径和低扩散系统带来的利益，同时能够符合美国药典<621>章色谱分析指南的规定。<621>章列出了允许的方法变化幅度。

噻康唑是一种用于治疗酵母菌感染的咪唑类抗真菌化合物。被转换的方法是噻康唑有机杂质的分析方法2。有机杂质分析方法用于测定样品中是否存在杂质及 其含量。该XP色谱柱方法是从最初在HPLC系统上的色谱柱规模的美国药典方法缩放至HPLC和UPLC仪器上的。在HPLC仪器上使用XP色谱柱对现行 美国药典方法进行改进能够缩短运行时间，从而提高了常规分析实验室的样品通量。而在UPLC系统上使用XP色谱柱则可以比HPLC进一步缩短运行时间并减 少溶剂的使用，从而节约了总成本。

实验条件

Alliance 2695 HPLC色谱条件

流动相： 44:40:28乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵

分离模式： 等度洗脱

检测波长： 219 nm

色谱柱（L1）： XSelect CSH C18，4.6 x 250 mm，5 μm，

部件号：186005291；XSelect CSH C18XP，4.6 x 150 mm，2.5 μm，

部件号：186006729；XSelect CSH C18XP，4.6 x 100 mm，2.5 μm，

部件号：186006111

柱温： 25 ℃

洗针液： 95:5乙腈/水

样品清洗液： 95:5水/乙腈

密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水

流速： 根据方法调整

进样量： 根据方法调整

ACQUITY UPLC H-Class色谱条件

流动相： 44:40:28 乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵

分离模式： 等度洗脱

检测波长： 219 nm

色谱柱（L1）： XSelect CSH C18 XP，4.6 x 150 mm，2.5 μm，

部件号：186006729；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 100 mm，2.5 μm，

部件号：186006111；XSelect CSH C18 XP，2.1 x 150 mm，2.5 μm，

部件号：186006727

柱温： 25℃

洗针液： 95:5乙腈/水

样品清洗液： 95:5水/乙腈

密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水

流速： 根据方法调整

进样量： 根据方法调整

数据管理： Empower 3软件

样品描述

用100%的甲醇将噻康唑样品制备成表1所述的浓度。将样品转移至一个进样用的TruView最大回收样品瓶中（部件号：186005662CV）。

结果与讨论

全世界制药企业都需要对常规方法制备的噻康唑进行日常分析。本应用纪要使用美国药典专论中规定的有机杂质分析方法，在几种不同规格的色谱柱上对噻康 唑及其有关物质A、B、C的分离进行了比较。因为噻康唑许多杂质缺乏实际可用性，所以将噻康唑有关物质A、B、C用作低浓度杂质标准品。美国药典所列的有 机杂质分析方法用于分析复杂的样品处方。样品中多种成分的有效分离通常需要使用更长的色谱柱。使用较大填料粒径（≥3.5 μm）的长色谱柱会使运行时间加长，溶剂使用量增大。例如，最初的美国药典中的噻康唑有机杂质分析需要使用4.6 x 250 mm，5 μm的色谱柱，分离时间长达30分钟，每分析一个样品需要耗费30 mL溶剂。但是，使用2.5μm粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱，可以在缩短运行时间的同时仍然符合考核的要求。由于运行时间缩短，样品通量得到了提高，每次分析所需溶剂减少，从 而降低了总成本。现行的美国药典<621>章色谱分析指南规定了允许的方法变化幅度。这些允许的变化包括±70%的色谱柱长度变化，-50% 的粒径变化，±50%的流速变化。1美国药典要求有关物质B和C之间的分离度要达到1.5，本应用纪要证明:在不同的色谱柱和不同的色谱系统之间进行的方 法转换完全满足对这两个难分离化合物的苛刻要求。

在HPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析

噻康唑的有机杂质分析方法需要使用L1专用色谱柱，为该分离而列出的色谱柱是LiChrosorb RP-182。参照沃特世反相液相色谱柱选择表，本文选用更先进的XSelect CSH C18固定相色谱柱。之所以选择XSelect CSH C18色谱柱是由于其与所列出的色谱柱相类似，并且能提供适用于HPLC UPLC仪器的各种规格和粒径。本文首先使用一根XSelect CSH C18，4.6x250mm，5μm色谱柱在Alliance HPLC系统上运行美国药典方法，流速1.0mL/min。如表2所示，本次分离符合考核标准。本次分离的总运行时间为30分钟，在连续批量分析样品时， 将面临着时间和成本管理的双重挑战。如果使用原始的美国药典方法， 8小时的一个工作日仅能分析16个样品，要消耗480mL溶剂。通过使用XP色谱柱，在同样的8小时工作日内可分析80个样品，且仅需使用240mL溶 剂，显著地提高了样品通量并降低了运行成本。

在不同的系统上使用2.5μm XP色谱柱改进的标准方法具有通用性，同时仍符合美国药典<621>章指南的要求，如图1所示。XP色谱柱是一款2.5-μm颗粒的HPLC 和UPLC色谱柱，经高效填装并能够承受UHPLC系统的高压，使XP色谱柱在HPLC和UPLC仪器上均能使用。

本纪要的标准方法首先从最初的4.6 x 250 mm，5 μm色谱柱转换至4.6 x 150 mm，2.5 μmXP色谱柱，用以说明使用更小粒径的色谱柱可以缩短运行时间。使用更小的粒径还可以提高分离能力，用色谱柱长度与粒径的比值（L/dp）即可预测。在 本例中，L/dp从50,000（初始条件）提高到60,000（4.6 x 150 mm XP色谱柱）。根据ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，用于该XP色谱柱的最佳流速为2.0 mL/min3。但是，这个流速超出了美国药典<621>章指南规定的变化范围。故采用1.0 mL/min的流速以保证符合美国药典指南的规定，同时也适应HPLC系统反压的限制。噻康唑及其有关物质在原始色谱柱上与在4.6 x 150 mm XP色谱柱上的分离进行了对比，如图2A-B所示。4.6 x 150 mm XP色谱柱将运行时间缩短43%，分离度提高5%，如图2所示。

接着使用一根更短的4.6 x 100 mm，2.5 μm XP色谱柱进行分离，用以说明在实现更快速分离的同时，仍保持着合格的分离度。运行时间的缩短对于有机杂质分析尤其有用归因于附加的分离复杂性，这些方法 一般比其他方法具有较长的运行时间。需要注意的一个重要问题是，不一定任何时候都会选用具有较低分离能力（L/dp 40,000）的较短色谱柱。例如在辅料和杂质洗脱时间很接近的情况下可能需要保持原始的分离能力。图2C显示了使用4.6 x 100 mm，2.5μm XP色谱柱进行分离时，与初始条件相比，运行时间缩短57%，并且仍然符合所有的考核标准，如图2所示。在这种情况下，L/dp从50,000（初始条 件）降低至40,000导致有关物质B与C之间的分离度降低15%；但分离度仍然符合要求，这取决于原始分离的复杂程度。

在UPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析

如图1所示，通过同时使用XP色谱柱和ACQUITY UPLC色谱柱计算器，该方法可以从Alliance HPLC系统转换至ACQUITY UPLC H-Class系统上。更新的仪器，例如ACQUITY UPLC H-Class系统，可以实现更快速、更高效的分离，归因于其高反压耐受能力、进样之间更快速的平衡以及显著降低的系统体积和扩散。为了对比HPLC和 UPLC系统之间的分离能力，将图2B中所示的使用4.6 x 150 mm，2.5 μm颗粒的 XP色谱柱进行的有机杂质分析方法在ACQUITY UPLC H-Class系统上重新运行，如图3A所示。仅仪器本身的变化——从HPLC变到UPLC，会使B与C色谱峰之间的分离度增加5%，使运行时间缩短 12%，如表2和表3所示。分离度的增大归因于UPLC系统的低系统体积和低扩散，因为这两个属性都可以改善峰形。

为进一步说明UPLC仪器的优点，如图3B所示在UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱进行分离。此分离操作使B与C色谱峰之间的分离度从使用HPLC系统时的1.6（参见表2）提高到使用UPLC系统时的1.8（参见表3）。在 UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱，得到与在HPLC系统上用原始方法分离相同的分离度，但是比原始方法快57%。

最后，将标准方法转换至一根2.1 x 150 mm 2.5 μm XP色谱柱上。这根色谱柱的测试结果说明通过减小色谱柱的内径，在保留相同分离度的同时，还能进一步缩短运行时间，并且大大减少溶剂用量。根据 ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，适合这根色谱柱的流速为0.42 mL/min。但这个流速超出了美国药典<621>章指南的要求，因此实验使用符合规定的0.5 mL/min流速。分析得到的色谱图（如图3C所示）显示，如表3所示与原始条件相比运行时间缩短80%，而适用性要求仍很容易达到。此外，仅仅通过减小 色谱柱的内径分析就比使用4.6 x 150 mm XP色谱柱快63%，如图3A所示。最后，通过使用2.1 x 150 mm XP色谱柱，与原始的标准方法相比，溶剂用量减少90%，显著地节约了成本。当对流速进行调整，以保持在美国药典<621>章指南规定的范围 内时，B和C色谱峰的分离度从1.9下降至1.8，但仍符合考核标准。

结论

在进行既耗时又费钱的有机杂质分析时，在现有HPLC系统上使用eXtended Performance [XP] 2.5 μm色谱柱，与原始的美国药典方法相比，可以缩短运行时间和减少溶剂用量57%。通过将XP色谱柱与UPLC仪器相结合，运行时间可减少80%，溶剂用量 可减少90%。既能在HPLC仪器上运行又能在UPLC仪器上运行的XP色谱柱的实用性可以用于在遵循现行美国药典<621>章指南的同时， 改进美国药典方法。在常规分析实验室中，使用经更小粒径色谱柱改进的美国药典方法，可以节约大量的时间和运行成本。