GasBench制备装置进行微量（μgC）溶解有机质的稳定同位素分析

有机质的稳定同位素能在碳循环动力学、微生物代谢和古气候方面提供有价值的信息。由于大体积测量可能掩饰有机库动态变化的关键部分，研究者增加了对于孤立的单个化合物的同位素分析。孤立碳的量经常很小，它的测量需要专门的设备。我们提出了一种简单的精确的方法，运用湿法氧化和GasBench Ⅱ制备装置测量淡水中溶解有机质和μg级有机化合物的δ¹³C值。包含3μgC的样品分析精密度是0.4‰，对于1.2μgC样品，精密度小于0.8‰。空白估计大约为0.2μgC。方法的精确度表现为很大的范围对于化合物包括那些难以被氧化的，例如腐殖酸和邻苯二甲酸。用这个方法测量的来自河流和沿岸地下水的DOC的δ¹³C值与那些用一个元素分析仪冷冻干燥DOC样品测得的值相符。低检出限和易于和独立技术例如液相色谱法相结合使这个技术适合用于有机化合物的线下分析，提供了不用高效液相色谱HPLC的复杂混合物中特殊化合物碳同位素分析方法的提高的可能性。

有机化合物稳定同位素微小变化被研究自然过程的地球学家广泛研究。现在存在的多种特殊化合物技术，分析物在层析色谱柱分离，然后立即转变为CO₂，用于同位素比值质谱仪（IRMS）的同位素分析。两个原来分离技术是结合焦炉燃烧的气相色谱（GC）和用湿法氧化的液相色谱（LC）。这些技术受限于分析物挥发性足够GC分离或能够被使用无碳的流动相LC分离。

为了绕过这些问题，发展了多种方法来测定少量碳同位素组成用线下方法。对于大量碳同位素分析应用最广的方法是元素分析仪（EA）与一台同位素比值质谱仪结合，但是需要数十微克到一毫克的碳。对EA 系统的修改，包括低温捕获样品燃烧产生的CO₂，为了让它随低流量的载气流进入装置，允许0.5μg碳的样品量，分析精密度为1.0‰。激光烧灼固体样品为小颗粒，然后燃烧成CO₂的方法，只需要65ng碳。最后开发了一个移动线接口，液体样品可以沉积在一个连续缠绕的镍丝，然后通过炉燃烧样品碳成CO₂，这个接口只需要大约9ng的碳，用于精密度为1.0‰的分析。虽然能够分析极少量的碳，这些技术仍然没有大范围的应用，主要是因为复杂的技术和日常应用中相应的困难。

这里我们提出了一种简单、精确和便宜的方法用于分析低至1.2 μg碳的有机碳样品的同位素测定。用过硫酸盐高温将有机物氧化成CO₂。然后生成的CO₂的同位素组成由一个GasBench 气体制备装置进行常规顶空采样，和耦合着一台同位素比值质谱仪的进样系统进行测量。

这种方法也应用于溶解有机碳的δ¹³C值（δ¹³C_DOC）的常规测量。一些耦合着总有机碳（TOC）分析仪和IRMS的系统已经开发。这些TOC分析仪的氧化技术包括过硫酸盐湿法氧化和高温燃烧。许多这些系统是完全自动化，有着明显的高样品处理量的优势和/或能够分析海洋或微咸水域。这里介绍的技术的优势是它的简单和不用使用一个单独TOC分析仪。

实验

尽管小规模和溶解有机碳同位素分析有些许不同，但是两个都包含三个基本步骤，每一个都在下文详细介绍：（1）样品等分和化学氧化剂一同加入到顶空小瓶，酸化，并用氦气吹洗，以除去无机碳。（2）将样品瓶加热到100℃使有机质被氧化成CO₂。（3）用GasBench制备装置连接到一个同位素比率质谱仪的装置测定顶空CO₂的同位素组成。

用于测量μg-数量的有机碳δ¹³C值的样品制备

有机化合物在12 mL的硼硅酸盐顶空瓶中被氧化成CO₂（Labco, High Wy combe, UK; P /N 938W）。所有的玻璃仪器先在500℃预燃烧5 h，以除去有机污染物。氧化剂改进自通常用于溶解有机碳浓度的分析。具体来说，24小时内配制的，1mL过饱和的过硫酸钾氧化溶液（100mL H₂O +4.0gK₂S₂O₈+200μLH₃PO₄（85%））用硼硅酸移液管加入到样品瓶。氧化剂的体积是由定量分析确定的。过硫酸钾充分溶解在几克热水中，然后等水冷却后收集固体，结晶两次来提高纯度。

加入样品和氧化剂后，立即将样品瓶用一个标准盖密封，标准盖上有一个单孔螺旋盖和丁基橡胶隔膜（Labco）。大气中的CO₂被用于碳酸盐分析的GasBench冲洗系统从从样品瓶中去除。具体而言，高纯氦气（5.0级，99.999% He）以100mL/min流速冲洗顶空3min。样品静置10min以便所有的残留在水溶液中的大气CO₂脱气到顶空中。然后顶空再次以以100mL/min流速冲洗3min。顶空超压通过针刺穿隔垫重新和大气达到平衡。然后将样品瓶放置在铝块上加热到100℃，保持60min来完成氧化反应。氧化后的样品冷却到室温。

溶解有机碳的样品制备

溶解有机碳样品的样品制备和小规模有机化合物的稍微不同。用一次性硼硅酸盐吸管将4mL的样品或标准加入顶空瓶，然后加入1mL的氧化剂。加入的体积是由重量分析决定的。样品用8.5%H₃PO₄（85%默克分析级磷酸（Merck, Darmstadt, Germany）用Milli-Q水（Millipore, Billerica,MA, USA）稀释10倍）酸化到PH＜3。为了除去无机碳，高纯氦气手工充溢（60mL/min）样品10min，用冲洗针刺穿隔膜。隔膜被两一根针刺穿，用于出气流。这个出口针连接着一根铜管，它的开口浸在水中，阻止大气中的CO₂回流到样品（图1）。10min后，移开氦气流针，出口针维持在原来的位置直到水中不再产生气泡，顶空和大气重新达到平衡。如上所述，将样品瓶加热到100℃，维持60min，完成氧化反应。在测量之前，冷却样品，使之平衡。

同位素丰度测定

顶空CO₂同位素组成的测量使用GasBenchⅡ在线气体制备和引入系统（Thermo Fisher Scientific, Bremen,Germany），配备有CTC自动进样器（CTC Analytics AG, Zwingen, Switzerland）耦合着ConFloⅣ和Delta Ⅴ质谱仪（都是Thermo Fisher Scientific）在ETH Zürich(Zürich, Switzerland)地质研究所。用双孔样品针刺穿丁基橡胶隔膜进行顶空采样（图2）。高纯氦气流（5.0级，纯度99.999%）以2mL/min流过样品顶空，然后通过八端口瓦尔特阀。样品被多次引入质谱仪通过每90s转换进入色谱柱的100μL样品环的容量。色谱柱（Poraplot Q熔融石英帽，25m，0.32mm；Thermo Fisher Scientific）维持在60℃）将CO₂和干扰气分开，尤其是N₂O。对于每一个样品，要测量三个参考气峰，样品气四次引入质谱仪。考虑到样品瓶中大量的水，必须做一些护理来阻止水分进入GasBench系统。自动进样器块保持在室温尽量减少顶空的水蒸气。样品针的深度必须校准保证尖端不接触到样品瓶水面。另外，隔膜内表面出现的任何水分液滴在分析之前都要通过轻敲或离心去除。

结果和讨论

优化氧化时间和冲洗次数

氧化反应温度（100℃）和氧化剂对样品的相对体积是根据用于DOC浓度分析和商业自动化湿化学氧化设备的条件决定的。有机化合物完全氧化的时间是有一个难以被氧化的标准邻苯二甲酸测得的。15min和60min的加热时间导致的峰面积和同位素组成是没有区别的（表1）。更长加热时间导致略微同位素组成贫化和峰面积更加多变，可能是因为丁基橡胶隔膜破裂或从隔膜中小泄漏的发生，尽管这些差别没有统计学意义。因此，所有后续样品氧化60min保证未知样品完全氧化。

在方法改进过程中，多种测量被用来最小化和描述空白的来源。这包括在氧化性溶液中氧化了丁基橡胶隔膜，更换了聚四氟乙烯内衬的隔膜和改变了H₃PO₄和Milli-Q水的体积。令人惊讶的是这些测试显示隔膜和空白的多少有很小的效应。我们发现，最大的影响和冲洗条件有关。样品瓶中充满了1mL或5mL的酸化的Milli-Q水，然后用氦气纯化不同的时间。上面提到长的纯化时间对于完全除去大气CO₂是必须的。较短的纯化时间导致很高的空白。

冲洗之前不稳定氧化物的氧化

极其不稳定化合物的氧化可能在室温下进行。这将是难以解决的，因为当氦气冲洗样品时任何生成的CO₂都将被去除。室温下氧化的程度，我们通过了一个测试来进行检验。向容易氧化的化合物，8.5μg的醋酸钠加入1mL的氧化剂，立即吹洗样品瓶。样品瓶一直保持在室温，顶空二氧化碳随后被分析。

15，30和60min后，顶空CO₂峰面积（表2，1.1到1.2Vs）和同时分析的空白没什么区别。300min后，峰面积略微升高（3.3Vs）。然后这个样品被加热到完全将有机物转化为CO₂，重新测量，峰面积为60.2Vs。因此，室温下易氧化的样品在1h后无可测量的转化，在300min后转化率低于5%。

氧化后样品稳定性

氧化后样品的稳定性通过氧化多等分的8.5μgC的邻苯二甲酸，然后在室温下储存直至进行顶空同位素分析。当氧化21天后，分析样品的δ¹³C值保持稳定（表3，δ¹³C=—33.1±0.3‰，n=8）。

优化顶空采样

在方法的早期测试中，准备的标准的第一个样品峰的面积和振幅变化很大，甚至当同位素值是及其可重复的。因为任何方法的空白的校正需要它的相对质量贡献精确的值，峰面积可以对引入系统的二氧化碳量进行校正是必须的。我们观察到当手动冲洗样品顶空，样品瓶略微超压，这些样品峰振幅较低，因为氦气较大的稀释。因此我们测试了样品瓶内压力对峰振幅的影响。

两套样品瓶被填充1,3或6mLMilli-Q水，每一个掺入150nmol的醋酸钠（300nmol C）。所有样品瓶的顶空用氦气冲洗5min。这个程序导致样品瓶略微超压，和稳压器上压力设备相符。一套样品瓶加热氧化后没有更多操作。另一套样品瓶向之前所描述的那样（图1）用针刺穿隔膜让顶空和大气压重新平衡。

当只用1mL液体时每次测量的第一个样品峰的体积是相似的（图3）。当样品瓶包含更多的液体时，大气压下的样品瓶的第一个峰的面积几乎是高压下的两倍。较小的峰面积会导致低精确度的同位素比值。所以所有的后续样品在氧化之前都要重新和大气压达到平衡。

由于这个程序，在单体运行中，第一个样品峰面积和标准的碳浓度及其相符（r²≥0.98）。然而，仪器响应和氧化剂量的微小变化在两个运行中对峰面积会产生很大的影响。因此，应该在每批样品中绘制标准曲线来决定碳的浓度。第一个峰面积再现性只有±10%（见下文），所以这些计算得到的浓度不能代替由更精确的方法得到的，如高温燃烧。然而，它们是有价值的，可以确定空白很低，标准和样品被完全氧化。

平衡分馏校正

样品氧化产生的二氧化碳在样品瓶中在气体和溶解相中会分开。平衡发生在已证实的同位素在气态和溶解CO₂中的分馏，ε_aq-g=-1.2±0.06‰在室温下。由于样品瓶是封闭体系，适当的校正取决于分布于顶空（F_H）和溶解于水中（F_L）的CO₂总摩尔分数（η_CO2）。这个分布能用亨利定律计算：C_CO2=P_CO2/K_H        （1）

C_CO2是溶液中CO₂的浓度，P_CO2是顶空CO₂的分压，K_H是亨利系数（29.41 L·atm·mol^-1）。C_CO2的这个定义相当于液体中被液体分离的CO₂的摩尔数（η_CO2·F_L/V_L）。CO₂的分压转而取决于定空中CO₂的量，能够用理想气体定律计算：

R是理想气体常数（8.314JK^-1mol^-1），T是凯尔文温度，V_H是顶空体积。两个方程联立，整理得：

通过这个关系就能计算平衡关系对样品同位素组成的影响。总样品CO₂会在顶空和气体中分配，能够由质量平衡计算：

从方程（3）和（4）可以看出，CO₂的分配和同位素校正必须依靠样品瓶中水的体积单独应用。在实践中，这意味着冲洗气体压力不影响分配或同位素分馏，也不影响样品瓶中CO₂的总摩尔数。表4提供了校正值，用典型的12mLGasBench 样品瓶内不同体积水的CO₂的δ¹³C值。

空白校正

程序空白对总测量浓度和δ¹³C值的贡献可以由质量平衡得出，表示为以下方程：

δ¹³C代表同位素组成，A代表第一个峰的面积总测量（下标T）的，样品（S）的和空白（B）的。如果精确知道空白特征，且A_S=A_T-A_B，样品同位素组成能够由下边方程计算：

在方法的改进中，为了确定程序空白，不含额外碳的氧化溶液经常被分析。空白面积的改变是由于仪器响应改变，氧化溶液纯度和大气CO₂存在。我们发现样品瓶冲洗不完全是空白信号最大来源；冲洗时间改变为实验结果中的一部分。仪器响应太低而不能直接获得一个精确的空白同位素组成。相反，它是由每次运行中与具有非常不同的δ¹³C同位素信号值的标准的预期值（邻苯二甲酸，-33.6%，葡萄糖，-11.3%）的差异计算的。这种改进是足够灵敏的，空白的同位素信号值可以被确定在0.5%。在1.2μgC样品中，空白经常贡献15-20%。因此，我们估计空白的大小是0.18-0.24μgC。

精密度，检出限和准确度

精密度的分析是采用蒙特卡罗法，由相关数值（A_T，A_B，δ¹³C_D，δ¹³C_B）误差传递计算的。总样品同位素组成测量的误差来自于每次测量内标的四个样品峰的偏差，对于振幅为1V或更高（＞3μgC）的样品＜0.05‰。空白的同位素组成（δ¹³C_B）可以由上述确定。样品（A_T）和空白（A_B）测量峰面积的误差由重复测量相同浓度的标准和空白来确定。。单体运行误差是±10%。两个运行的峰面积可以变化很大，所以对于每一批未知样品的测量，测量一系列标准和空白是很重要的。对于一个样品的δ¹³C的计算测量精密度对于大于或等于3μgC的碳数量是＜0.4‰。对于1.2μgC的样品是＜0.8‰。在浓度范围为1.2-12.1的邻苯二甲酸多次测量的再现性是±0.4