RPE-Cy7串联染料丨抗体修饰、PE串联激活方法

PE-Cy5是属于藻胆蛋白缀合物家族的串联染料。在这种类型的串联染料中，激发能可以从PE转移到Cy5，zui大发射波长为Cy5。PE-Cy5与FITC和PE具有zui小的光谱重叠，导致低荧光干扰。因此，它在实验中与FITC和PE联合使用。需要注意的是，PE-Cy5不适合与APC配对，因为它们具有显著的光谱重叠。与PE-Cy5相比，PE-Cy5.5对FITC、PE和APC的荧光干扰最小，使其与这些染料的组合相容。此外，与PE-Cy5相比，PE-Cy5.5表现出更高的荧光强度。PE-Cy7与FITC没有光谱重叠，与APC的重叠zui小，使其能够与FITC、PE和APC结合使用。然而，需要注意的是，PE-Cy7对光漂白高度敏感，并且在实验期间需要严格的光保护环境。

艾美捷RPE-Cy7串联染料：

Cat #：B-CHM311/B-CHM312/B-CHM314/B-CHM315

规格：1 mg/10 mg

储存：储存温度为4°C，避光。

形式：固体

纯度：Amax/A280>5.0

储存条件：储存温度为4°C，避光，不结冰。

稳定性：在适当的储存条件下稳定至少6个月

RPE-Cy7串联染料使用说明：

1.抗体修饰

1） 将抗体修饰试剂（DTT/TCEP）溶于ddH2O中，制备2 mg/ml抗体修饰缓冲液。

2） 使用PBS缓冲液将待标记抗体的浓度（纯度>90%）调节至约5-10 mg/ml。向每毫克抗体中加入10μl抗体修饰缓冲液，轻轻混合。在室温下搅拌混合物60-90分钟。

3） 反应完成后，将混合物转移到离心过滤管中，并加入MES缓冲液。离心过滤器多次以除去过量的抗体修饰缓冲液。过滤器中收集的溶液是经修饰的抗体，应将其调节至1-5mg/ml的浓度。

2.PE串联激活

1） 将PE串联溶于浓度为5-10mg/ml的0.1M PBS（pH 7.4，5mM EDTA）中。

2） 将SMCC溶解在无水二甲基亚砜中，制备10mg/ml的储备溶液。

3） 每mg PE串联染料添加Sul的SMCC（n（PE串联）：n（SMCC）=1:80）。用铝箔密封反应混合物，并在室温下旋转1小时，使PE串联上的氨基与琥珀酰亚胺酯反应，形成衍生的PE串联。

4） 反应完成后，将反应混合物转移到超滤离心管中，并在4°C、12000g下离心5分钟以除去滤液。加入500μul MES缓冲液，混合并离心。重复此步骤5次。

5） 收集活化的PE串联溶液。

3.活化的PE串联与抗体的结合

1） 使用MES缓冲液将活化PE串联的浓度调节至5 mg/ml。为了获得活性PE串联的准确重量，我们建议使用活性PE串联形式测量的消光系数（[PE串联]=0.1245×A565，其中[PE串联]是以mg/ml为单位的浓度，A565是565nm处的吸光度，优选在0.3-0.8的范围内）。

2） 将修饰的抗体与活化的PE串联以1:3的质量比混合（3mg修饰的抗体的活化的PE串列排列）。在室温下避光反应2小时。

3） 将NEM溶解在无水二甲基亚砜（DMSO）中，制备12.5 mg/ml溶液（0.1 M）。在步骤2）的反应混合物中，每毫克抗体加入5μl-NEM溶液，以阻断任何剩余的活性基团。

4） 将步骤3）中的溶液转移到离心过滤管中，并通过重复离心去除阻塞缓冲液。

5） 将标记的抗体分成等分，添加适当的防腐剂，并在-20°C下储存以备将来使用。

注意事项：

1.活性PE串列应在黑暗中冷藏。在贴标签的过程中，应尽可能避免光线照射。

2.封闭试剂和修饰试剂应新鲜配制，并立即使用。它们不应该存放很长时间。

3.标记的抗体应具有高特异性和不低于90%的纯度。单克隆抗体是首选，溶液中不应含有游离胺。最好使用PBS。在标记之前，抗体应该耗尽NaN3和BSA。透析、浓缩和浓度测量等操作可能会导致抗体损失。因此，应根据具体情况确定用于标记的抗体的适当量。

4.由于修饰抗体中引入的基团对再氧化的敏感性，修饰后的抗体应尽快与活化的PE串联偶联。

PE-Cy7:

https://www.amyjet.com/products/B-CHM311-1mg.shtml