分子生物学当中的经验教训及技巧
上一篇 /
下一篇 2013-12-14 23:32:59
大家平时做实验，肯定都有很多小的技巧，在书上都看不到的，也没有系统的整理，但是确实能够起到很好的作用，不妨在这里与大家分享一下。
任何专业任何点滴的东西都行，也许就对别人有一点好处哦！
举个例子：
我在用酶标板加样的时候，蛋白样品常常会产生很多气泡，如果做荧光实验，由于灵敏度非常高，一点点微小的气泡都会影响很大，常常又不可能加消泡剂，我就用卫生纸，撕下来一下条，搓成小针，碰一碰气泡就破了，很好使：）
1、酶切或者PCR体系混合好以后，大家都会用手指轻弹EP管的底部来混匀溶液，常常出现很多气泡。这时候轻弹液面上方的管壁，消除气泡就轻而易举了。千万别弹液面下方的，气泡会越来越多。
2、CR不要一次做太多样品 有时候机器不稳定 影响结果
3、用卫生纸是一个，我觉得最好的是用接种针烧热了之后去戳一下，防止被卫生纸污染哈
建议瞬间离心一下是最好的，不但消除气泡，还有将管壁上的液体离下来，否则可能不够分装
4、卫生纸主要成分是纤维素，一般并不会污染样品，除非你做分析实验，之所以用卫生纸是因为它会吸水，减少水的表面张力，很容易就让气泡破裂了
5、磁珠回收时，不要贪多，收集上层即可，太过影响DNA的纯度和质量，对链接、转化有影像。
6、各种buffer都要完全融化后才能用，而且不管什么药品，如果只剩下最后一点底子了，最好放弃，因为可能会影响你的实验
7、动手前，一定要思路清晰，尽量把要做的事情列出来
8、做前一定要在笔记上写上1、2、3.....，在按照笔记一步一步做，否则容易出错。
9、要加的酶阿，dNTP，水啊之类的能分装的话最好分装好一点，万一污染的话就全完了
10、实验前,列个表单,列明关键点.避免出错.这样费一点时间是值得的.不要太相信自己的记忆.
孤风逐日：任何试剂反复冻融对其效率都有很大地影响。所以买来的试剂第一次使用时要注意按每次实验用量分装保存。提取的模板或纯化的样品也最好分装保存，以备不测。
很多个人经验在个板块相关分析中都有一些提及，只要多加留意就可以学到很多高手的不传经验。
11、同时做很多管PCR时的加样技巧
例如，需要做n管PCR：
1. 如果用同一对引物扩不同的模板，可以先按照事先确定的比例，按照n+2的量把水，反应缓冲液，dNTP，镁盐，引物和Tag酶先加到一个大管里面，混匀后就是“预混合液”了，然后把“预混合液”分装到做PCR用的小管里面，通常我会分装n+1管，最后向前n管里面入模板，混匀，最后一管不加模板而是加入和模板等量的无菌水，作为对照，以检查加样过程中是否引入了污染，接下来就可以进行PCR反应。
2.如果用不同的引物扩同一模板（不做多重PCR），则将第1点的引物和模板次序调换即可。
3.同理，如果用不同的引物分别扩不同的模板，则将引物和模板留在最后分装后再分别加入。
这样做的优点：可以大量减少取样次数，减少了不同PCR管之间的误差（这一点对于荧光定量PCR尤其重要）；节省时间。
缺点：如果在制备预混合液时的任何一步引入了污染则会导致这一批次的所有PCR反应都被污染，所以我每次都做一个阴性对照（用无菌水替换模板），以检测是否被污染。
12、如果遇到试验有很多步，只是自己看protocol做，没有人带而且是第一次，我建议确立好步骤，然后每做一步的时候只注重眼前这一步，认真的做，不出错。这样每一步都只是关心眼下，可以集中精力，并且每一步都保证无误，最后结果应该不会太坏，而且即使出了问题，可以排除操作的因素。
13、跑PAGE胶染色的技巧吧：
其实是我自己的亲身体会，大家都知道如果严格按照protocol上的去做不但浪费药品，也浪费时间，程序还繁琐，当然代价也高些。
1、如果你跑的是小板的（SSR之类的分析足够），那么先找来4个1升左右的空塑料瓶，洗干净（我用的是上海国药的装尿素瓶，带盖的），用来分别装银染要用的固定液、染色液（硝酸银）、显影液、纯水，在每个上面分别写上名字，以免弄错，每次回收这些溶液后，把盖子拧紧，以阻止一些挥发或分解吧，延长使用“寿命”。
2、一般的书上都说显影液只能用一次，其实完全不至，我一般都是至少用2次，根本一点问题都没有。还有固定液和染色液也可以适当多用几次，只要能然出来就行。
3、有的时候实验室用超纯水so多，也so浪费，或是一时半会制不出来，而染色要用怎么办呢，我无意中就用蒸馏水代替，什么问题都没有，根本没啥差别，甚至于后来我压根都不用蒸馏水了，干脆改自来水，也没啥问题，完全可行，不信大家可以试试，呵呵，虽然说是可能某些地方不是很合理，但对一般像做分子标记之类的根本没啥影响，替老板能省就省点吧，大家都不容易，哈哈!
还有我忘了说了，以前经常跑完胶后来不及染色就得回寝室了，怎么办呢，不用熬夜，就把胶剥离下来泡在固定液里，第二天早上再来接着下面的步骤一点问题都没有，就是可能胶尺寸会有些变化，但绝对不影响你的结果。
最后一个就是读带问题，我见过别人好多种方法，但我自己“发明”了一种实用、准确的：
找一块大点的普通玻璃板(我当时用的是跑大垂直板胶的），带上手套（保护好自己，虽然聚合后毒性小，但还是有的），快速把胶捞出来，放在玻璃板上，再迅速把玻璃翻个面，平放在观片灯上，只要你速度快，胶是不会掉下来的，会紧紧贴在玻璃上的，最好玻璃板和管片灯的平面有点空隙，否则胶粘住观片灯表面就会把灯面弄脏，胶也可能会掉，一切弄好后，你就可以直接那笔在玻璃的这个干净面上一清二楚的读带，直接可以往上面写带型，然后为了以后检查用，最好用数码相机快速拍照保存，不但胶上的带可以看清，你在玻璃上写的带型数字也是非常清楚的，当然读完的胶就可以立即扔掉，没必要保存
14、做实验时，认真做好记录，写好实验结果，过一段时间再去看看，温故而知新
15、有些时候做完ＰＣＲ，由于条带很淡，但你想回收．不妨将有目的条带的胶切下来．放到－２０度冻一会，拿出吸它的液体作摸板，再扩增效果很好！！
16、做转染，我养过四五种细胞，都做了转染，但每种的转染率都不一样，本人当时就吃了这个亏，提醒大家，谁做转染事前先查一下要转的细胞转然率怎么样。
还有就是我在用脂质体2000做转染时，一次发现转染6小时后的液体打到其他细胞里仍可以转进去，所以为了提高转染率，我以后在6小时的时候都没有把转染液体打出去，只是又加了含血清的培养基。
但有一个问题就是，不打出去的话，细胞会死很多，这个也与养的细胞种类，状态都有关。
17 PCR预混:预混一般根据样品的多少，一般我在预混的时候大概每个样品管中预计损失0。5－0。6微升，这样计算需要的总的预混液数量，比较合适。
18、做实验前 一定先写出步骤和列出实验所需要的试剂和器材，下面看看哪些是要购买的，哪些是需要清洗的，哪些是要前处理的如过滤、高压。
定试剂一定要打提前量，不好买的试剂一定要在3周左右前订购，如在SIGMA订货。
实验的时候一定要坐好标记！！什么时间，多少浓度，如PH值,是否过滤了，
做完实验有写离心或过滤的残液，先不要丢弃，万一实验失败，还要重复的。
实验中的每个环节都很重要
忽略任何一个都可能导致实验的失败
每个人在实验中都有自己的一些好的细小的习惯
例如tip头吸完后马上从移液器上取下来，以免忙乱的时候又以同一tip汲取另一种试剂
用完量桶或者烧杯后，及时清洗，并放入烘箱。
不管大小实验，做完后都要认真做记录。
一个枪头如果可以连续吸两次的话，也不能吸，主要是第二次吸时不准，同时也不能完全打出来。
做完实验擦干桌子，一切东西归位，有些东西可以回收的就回收，很多实验室的枪头是回收的
实验前认真设计，作实验时不胡思乱想，叽叽喳喳，做完后在海阔天空，认真分析试验数据
做之前认真设计,做时就不要老是想着结果,平心静气,注意细节，认真记录，因为失败是常事，不要回过头不知道该从哪里找原因。
每次的实验结束，要及时做好记录，不要等。好记性不如烂笔头，这虽然是俗语，但是不要放弃笔的重要性！
加入试剂之前,把它混匀一下,以免放置时间长了浓度不均
做完实验，清理实验台，以便下次能够更快、更好，更方便的继续工作！药品归位，仪器归位！
做实验一定要有计划,最好在有部分实验数据出来时,就着手写文章,这个不是为了出文章,而是在写文章的时候,可以清晰自己的思路,知道后面该先做什么,该重点做什么.不然有时候辛苦半死,数据太分散,不能说明问题.
不轻易用别人的东西，用时先打招呼，记录要详细，配液体时要记录试剂的批号等?
所有的东西都要即时标记好，日期，药品名称，浓度，等
移液枪用完之后要归到最大计量的位置，防止久而久之弹簧失去弹性。
不用酶标枪时不要一直拿在手里，不可以倒过来（特别是里面还有液体的时候）
不要一直说话、聊天~~
笔记要全~要多全有多全~
还有一点很关键，笔记要放好，最近我的笔记掉了~哭死
最后，做完实验要洗手~
离开实验室前或进入实验室前注意水，电是否安全
试验之前看资料的时候，最好规类存放，看过后记下重点内容，并将出处标明，以免日后找不到
一定要记着关水浴箱，切记切记。
|
导入论坛收藏
分享给好友
推荐到圈子
管理
举报
TAG:
