芫花根的HNMR指纹图谱解析
郑维发,石枫
关键词:芫花根;HNMR指纹图谱;分级提取
摘要:目的:建立芫花根的HNMR指纹图谱,以揭示其次生代谢产物类别的组成,为芫花根有效成分脱毒提取工艺的研制提供检测手段。方法:以CDCl3/DMSO-d6 为溶剂,在25℃测定芫花根石油醚-丙酮-甲醇提取物HNMR图谱。各质子共振信号强度以相对积分面积表示。用HNMR图谱考察石油醚→丙酮→甲醇和氯仿→乙醚→乙酸乙酯→甲醇两个分级系统芫花根的各级提取物化学组成的变化。结果:芫花根HNMR指纹图谱出现了长链烃或二萜原酸酯的质子、芳环质子、吡喃糖基质子以及多个羟基共振信号,提示芫花根中存在二萜原酸酯或长链烃类、黄酮和香豆素等芳香族化合物。不同分级溶剂提取物的1H NMR有显著差异。随着分级提取溶剂的极性增加,高场区质子信号强度迅速减弱,低场区羟基信号、糖基质子信号强度迅速增加。结论:芫花根HNMR指纹图谱具有特征性和专属性,可作为芫花根有效成分脱毒提取工艺研究提供简便可靠的检测方法。
芫花(Dephne genkwa Sieb et Zucc)为瑞香科植物,广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。芫花根具有消炎、镇痛、镇静及抗惊厥等多种药理作用。研究表明,芫花根中主要含有黄酮、香豆素和萜类化合物。其中黄酮类化合物除了芫根苷等少数单黄酮外主要含有daphnodorin系列双黄酮,种类多且含量高,为芫花根皮中主要成分之一。香豆素类化合物主要有伞形花内酯,西瑞香素等及其苷类化合物,为芫花根另一类主要成分。这两类化合物种类多、含量高,构成了芫花次生代谢产物的主体。芫花根中另一类代表性成分为二萜原酸酯类,该类成分具有强烈的刺激性,对皮肤、黏膜系统有较大的毒害作用,是芫花根抗生育的有效成分,也是芫花根特征性有毒成分。由此可见,芫花根药理活性成分与有毒成分同时并存。如何以最经济的方式去除芫花根有毒成分,最大限度地保留药理活性成分已成为芫花根提取工艺的关键。建立芫花根指纹图谱对研制芫花根脱毒提取工艺或其有效成分定向提取工艺具有指导意义。我们在得到芫花根黄酮、香豆素和二萜原酸酯类等特征化合物的基础上建立了芫花根HNMR指纹图谱,测定并解析了芫花根不同溶剂提取物的1H NMR图谱,运用芫花根HNMR指纹图谱观察了各级提取物中各类次生代谢产物组成的变化。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
芫花根于2002年3月采于安徽省南部山区,生药经南京中医药大学叶定江教授鉴定,室温自然风干。硅胶(青岛海洋化工厂) 、Sephadex LH-20。核磁共振波谱仪(Bruker AV400) 、HP5973型质谱仪、紫外波谱仪(Genesys 2) 。1. 2 方法
1. 2. 1 特征化合物的分离及鉴定
取芫花根2kg,石油醚2丙酮2甲醇(1∶1∶) 80℃回流24 h,提取物以硅胶柱色谱分离,石油醚-丙酮(100∶0～1∶
1)梯度洗脱,得化合物1以及8个组分。组分3经多次硅胶柱层析(氯仿2丙酮, 6∶4)得化合物2和3;组分4经Sepha
dex LH-20凝胶柱层析得化合物4;组分5反复经Sephadex LH-20凝胶柱层析得3个黄色针状晶体(化合物5,6,7)以MS、HNMR、CNMR、H-H COSY、HSQC和NOESY等光谱学方法鉴定化合物分子结构。
1. 2. 2 不同溶剂分级系统的提取物制备
取芫花根150g,其中50g以石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)80℃水浴回流1h; 50g以氯仿→乙醚→乙酸乙酯→甲醇
按先后顺序分别在80 °C水浴分级回流提取1h; 50g以石油醚→丙酮→甲醇按先后次序分别在80℃水浴分级回流提取1h。提取液经浓缩碱压干燥,于硅胶干燥器中保存。
1. 2. 3 各级提取物HNMR谱图测定
取石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物100mg,各试剂分级提取物取50mg,溶解于0.5mL 的CDCl3、DMSO-d6(1∶1)混合试剂,于25℃测定各级提取物的HNMR。HNMR中各质子共振信号参照2.508mg/g DMSO-d6中甲基峰面积进行积分,以得到的相对积分面积表示质子共振信号强度。
2 结果
2. 1 特征化合物的光谱学数据
化合物1浅黄色针晶(氯仿-甲醇= 1∶1) ;m.p.244～247℃;UV (MeOH)λmax:229,265,325,343nm; ESIMS (m /z) ; 353.1317[M+H]+; HNMR(400MHz,CDCl3∶MeOD-d4= 2∶1):δ11.60(1H,s,OH) ,8.05 (1H,d,J=9.2 Hz, H-4)，7. 86(1H,s,H-4),7.70(1H,d,J=8.4Hz,H-5),7.22(1H,s,H-5),7.18(1H,d,J=2Hz, H-8),7.09(1H,dd,J=8.4,2Hz, H-6),6.78(1H,s,H-8),6.38(1H,d,J=9.2Hz,H-3),3.81(3H,s,OCH3 );13CNMR(100MHz, CDCl3:MeOD-d4=2∶1) :δ160.0(C-2),159.8(C-2),157.1(C-7),154.9(C-9),150.3(C-7),147.6(C-9),145.7(C-6) ,144.0(C-4),135.6
(C-3),131.0(C-4),129.1(C-5),115.0(C-10),113.8(C-3) , 113.4(C-6), 110.2(C-10),109.4(C-5),104.0 (C-8),102.6(C-8),56.0(OCH3)。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物2为西瑞香素。
化合物2棱柱状晶体(甲醇);m. p.205～207℃;ESIMS(m/z):649.1381[M+H]+; 1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.05～7. 85(2H,m,Bz-2H),7.70～7.30(3H,m,Bz-3H),7.53(1H,br.s, J = 1.6Hz, H-1),6.63 (1H,dd,J=16,9.6Hz,H-23) , 6.30～5.40(2H,m,H-24,H-25),5.60(1H,dd,J =16,3.2Hz,H-22),5.15(1H,s,H-12 ),4.96(2H,br.s.,J=0.4Hz, H-16),4.86(1H,d,J=3.2Hz,H-14),4.12(1H,d,J= 4Hz,H-5),3.96(1H, s, 52OH),3.80 (1H, br. s. , H-10) ,3.77 (2H,s,H-20),3.57(1H,d,J=3.2Hz,H-8),3.55(1H,s,4-OH),3.54(1H,s,H-7),2.50(1H,q,J=6.8Hz,H-7),2.29(1H, br.s,20-OH) , 2.05(2H,q,J=6.8Hz,H-26),1.80(3H,br.s,J=0.4Hz,H-17),1.48( 3H,br.s, J=1.6Hz,H-19),1. 33(3H,d,J=7.Hz,H-18),1.29(6H,m,H-27,H-28,H-29),0.86(3H,t,H-30)。数据与文献报道的结果完全一致,故化合物3为yuanhuadine。
化合物4 黄色针晶(氯仿);ESIMS(m/z):163.1251[M+H]+;HNMR(400MHz,acetone-d6):δ10.18(1H,s,OH),7. 87(1H,d,J=8.8Hz,H-4),7.45(1H,d,J=8.4Hz,H-5),6.70(1H,dd,J= 8.4,2.4Hz,H-6),6.65(1H,d,J=2 4Hz, H-8) , 6.13(1H,d,J=8.8Hz,H-3);13CNMR ( 100MHz,acetone-d6):δ161.7(C-7),160.8(C-2),156.1(C-9),144.7 (C-4) , 130.1(C-5),113.5(C-6),111.6(C-3,C-10)102.8(C-8)。数据与文献完全一致,因此,鉴定化合物4为伞形花内酯。
化合物5 浅黄色无定形粉末;UVλmax (MeOH):330,297,284,228nm; ESIMS(m/z):559.1246[M+H]+;HNMR (400MHz,CDCl3:MeOD-d4=1∶2):δ11.55( 1H,s,OH),10.09(1H,s,OH),9.13(1H,s,OH),8.79(1H,s,OH),8.47 (1H, s,OH),7.36(2H,d,J=8.4Hz,H-2Ê, H-6Ê) ,7.03 (2H,d,J=8.4,H-2, H-6′),6.80(2H,d,J=8.4Hz,H-3Ê, H-5Ê) , 6.73(2H,d,J=8.4Hz,H-3′, H-5′),6.28(1H, s,H-6),6.04( 1H,d,J=2Hz,H-6″),5.76(1H,d,J=2Hz, H-8″) , 5.38(1H,s, 3″-OH),4.72(1H,d,J=6.8Hz,H-2),4.26(1H,d, J=4.8Hz, 3-OH),3.90 (1H,m,H-3) , 2.80 (1H,dd, J=16.4,5Hz,H-4a),2.62( 1H,dd,J=16.4, 7.6Hz, H-4b) ;13CNMR (100MHz, CDCl3 :MeOD-d4 = 1∶2):194.4 (C-4″) ,168.2 (C-7″) ,164.7 (C-5″) ,162.9 (C-9″),161.4(C-7),159.5(C-5),158.9 (C-4Ê),157.9(C-4′), 153.4(C-9),130.3 (C-1′),129.7(C-2Ê,C-6Ê),128.5 (C-2′, C-6′,),126.2 (C-1Ê) ,118.2 (C22″) , 116. 1(C-3′, C-5′),115.4 (C-3Ê, C-5Ê),103.8(C-10),107.9 (C-8),99.8(C-10″),97.6(C-6″),95.6(C-8″) , 91.9(C-6),81.8(C-3″),81.7(C-2),67.7(C-3),28.2(C-4)。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物5为Daphnodorin G。
化合物6 黄色针状晶体(甲醇);m.p.215 ～217℃;UVλmax (MeOH);308,215nm;ESIMS(m/z):543.1119[M+H]+; H NMR(400MHz,CDCl3:MeOD-d4=1∶2):δ12.40(1H,s,OH),11.10(1H,s,OH),10.40(1H,s,OH),9.61(1H,s,OH),9. 54 (1H,s,OH),9.17(1H,s,OH),7.24(2H,d,J=8.4Hz, H-12″, H-16″) ,6.81( 2H,d,J=80Hz,H-2, H-6′),6.73 (2H,d,J=8.4Hz,H-13″,H-15″),6.62 (2H,d,J =8.0Hz, H-3′, H-5′),6.61( 1H,s,H-6),5.67(2H,s,H-7″, H-
9″),5.01(1H,d,J=5.2Hz,3-OH),4.61(1H,d,J=7.6Hz,H-2),3.70(1H,m,H-3),2.70 (1H,dd,J=16,5.6Hz,H-4a) ,
2.52(1H,dd,J=16,8.6Hz,H-4b) ; 13 CNMR ( 100 MHz,CDCl3 :MeOD-d4 = 1∶2):80.4(C-2),66.3(C-3),28.4(C-
4),153.4(C-5 ),89.6(C-6),141.3(C-7),106.0(C-8),152.4(C-9),103.2( C-10 ),129.0 ( C-1′),127.1( C-2′),114.3 (C-3′),157.2 (C-4′),114.3 (C-5′),127.1 (C-6′),146.7 (C-2″),117.1 (C-3″),194.2(C-4″),105.9 (C-5″),164.2 (C-6″),94.4(C-7″),165.4 (C-8″),94.4(C-9″),164.2(C-10″),121.3(C-11″), 126.5 (C-12″),115.4 (C-13″),156.1(C-14″),115.5(C-15″),126.5(C-16″) 。数据与文献报道的结果一
致,故化合物6鉴定为Daphnodorin B。
化合物7 浅黄色针晶(甲醇);UV(MeOH)λmax:268,295,336nm; ESIMS (m/z):285.1035 [M+H]+;HNMR(400MHz,MeOD-d4):δ13.07 (1H,s,5-OH),10.38 (1H, s, 4’-OH) ,7.93 ( 2H, d, J=8.4Hz, H-2 ’, H-6 ’),7.07 ( 2H,d,J =8.4Hz,H-3’, H-5’),6.87(1H,s,H-3),6.65(1H,d,J=2.4Hz,H-8),6.36(1H,d,J=2.4Hz, H-6),3.88(3H,s,OCH3);CNMR (100MHz,MeOD-d4):δ180.5(C-4),165.0(C-7) ,164.1(C-2),161.2(C-5),161.1 (C-4 ’),157.0(C-9),128.3(C-2’,C-6’) ,121.0 (C-1’),115.9 (C-3’, 5’),104.6(C-10),102.8(C-3) , 98.0(C-6),92.5(C-8),56.1(OCH3) 。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物7为Genkwanin。
2. 2 特征化合物1H NMR波谱学特点
化合物1、4芳环质子信号集中在6～8.3ppm之间。质子被甲氧基取代,甲基共振信号出现在4.0～3.7ppm之间,质子被羟基取代,则羟基活泼氢信号多出现在8～13.4ppm之间。化合物5、6、7芳环质子信号也集中在5.5～8ppm之间,其中,daphnodorin系列双黄酮( 5、6)的吡喃环内H-2在4.5～4.9ppm之间出现特征性的d峰(J=7.6) 。若H-3位为-OH取代,则另一质子信号出现在3.7～3.9ppm之间,信号被裂分成多重峰。H-4则在2.56～2.7ppm出现dd峰(J=16,8.6)。芳环羟基信号出现在8.4～13.6ppm的低场区。化合物2、3在高场0.86、1.29ppm出现二萜原酸酯类化合物中长链酯类特征信号; H-20在3.77ppm有一特征性的羟甲基单峰信号;H-16在4.96ppm处有一特征性的末端次甲基加宽峰。
2. 3 芫花根HNMR指纹图谱
石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)混合溶剂是集弱极性、中大极性为一体的溶剂体系。根据相似相溶的原理,该溶剂体系提取物的总成分基本能够反映芫花根次生代谢产物的总成分。因此,将石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物作为芫花根HNMR指纹图谱的研究对象。芫花根总成分HNMR图谱从高场0.75～0.9ppm出现了与次甲基邻偶的末端甲基信号群,积分面积为1.30;1.29ppm左右出现了典型的多个次甲基邻偶信号,积分面积为10.65。提示芫花根中存在二萜原酸酯或长链烃类化合物。低场区8.0～13.6ppm出现了众多的羟基信号积分面积达4.53; 6.5～8.0ppm之间出现密集的芳环质子信号,总积分面积达6.26。这些信号表明芫花根次生代谢物中含有多种黄酮和香豆素等芳香族化合物。4.0～5.2ppm之间出现了密集的质子d峰信号,其中在4.6ppm左右出现了两个强度较大d峰。
2. 4 芫花根不同分级提取物的HNMR图谱
这些信号系daphnodorin双黄酮吡喃环H22的特征信号, 2.4～2.8ppm 出现强度较弱的多组质子共振信号,为daphnodorin双黄酮吡喃环H-4的特征信号。这些信息表明,daphnodorin系列的双黄酮是芫花根次生代谢产物中的主要成分之一。在5.21ppm处有一很强的d峰信号,为吡喃糖H-1特征信号,同时3.0～4.0ppm之间出现总积分面积达17.59的吡喃糖基质子信号群,表明芫花根有含量很高的苷类化合物。
2. 4. 1 石油醚→丙酮→甲醇分级提取的芫花根HNMR图谱
该溶剂顺序分级提取的各级提取物HNMR指纹图谱呈现一定规律的变化。石油醚一级提取物HNMR图谱0.86ppm的末端甲基相对积分面积达26.01。1.29、1.65、2.25ppm处的次甲基相对积分面积分别为157.40、16.07和12.47。表明石油醚一级提取物主要含有弱极性的长链烃和二萜原酸酯类化合物。丙酮二级提取物的HNMR图谱在0.86、1.26ppm处的质子相对积分面积分别下降到2.20和7.79,表明经过石油醚的提取,长链烃和二萜原酸酯类化合物含量已有很大的降低。该提取物在4.5～5.10ppm之间出现了多个daphnodorin系列双黄酮吡喃环H-2的特征信号, 6.51～7.20ppm出现密集芳氢质子信号,结合在8.0～13.4ppm出现的多数羟基信号可以判定丙酮在80℃时对芫花根双黄酮、香豆素或其他酚类化合物有很强的萃取力。甲醇3级提取物HNMR图谱0.86、1.26ppm的相对积分面积分别减至0.18和0.45。说明经过2级提取芫花根弱极性成分包括有毒的二萜原酸酯类含量已大大降低。该级提取物HNMR图谱在2.4、2.56ppm出现了daphnodorin系列双黄酮H-4的dd峰特征信号,4.0～5.03ppm之间出现众多
daphnodorin系列双黄酮H-2特征的d峰。表明该级提取物中含有daphnodorin系列双黄酮。在3.0～3.8ppm之间出现密集的吡喃糖基的质子信号, 5.21ppm出现了吡喃糖基H-1特征宽单峰。这些质子共振信号表明,该级提取物中还含有含量较高的苷类(黄酮苷或香豆素苷)化合物。
2. 4. 2 氯仿→乙醚→醋酸乙酯→甲醇分级提取的芫花根HNMR图谱
该溶剂顺序提取的各级提取物1H NMR指纹图谱也呈现出类似的变化规律。弱极性成分如长链烃、二萜原酸酯类化合物主要集中在氯仿一级提取物中。乙醚二级提取物中开始出现daphnodorin系列双黄酮、香豆素类化合物的共振信号,乙酸乙酯三级提取物中除了出现daphnodorin系列双黄酮的特征共振信号外,在3.0～3.8ppm之间、5. 21ppm还出现吡喃糖基的质子特征共振信号,说明daphnodorin系列双黄酮和苷类(黄酮苷或香豆素苷)化合物是该级提取物中的主要成分。甲醇4级提取物与醋酸乙酯3级提取物成分相似,但甲醇4级提取物中含有含量更低的二萜原酸酯类化合物和含量更高种类更多的苷类化合物。
3 讨论
次生代谢产物是植物药具有药理作用的物质基础。植物药总提取物的HNMR指纹图谱反映其化学成分的结构和相对组成方式。多种不同极性溶剂以固定的比例组成混合溶剂,在80℃对植物中多种不同极性的次生代谢产物具有很强的萃取力。由此获得的植物总提取物可视为植物次生代谢产物的整体化学组成。本研究以石油醚2丙酮2甲醇作为提取溶剂在80℃对芫花根回流提取1h,得到的HNMR图谱显示提取物中含有弱极性的长链烃和二萜原酸酯,中等极性的黄酮、香豆素等芳香族化合物和大极性的苷类化合物。基本反映了芫花根次生代谢产物的整体组成及其特征性成分。有作者认为植物药HNMR指纹图谱要以特征的标准提取物为研究对象,以显示同属种间和同种不同产地的差异。所谓特征性的标准提取物是指以标准的提取分离手段从植物药中获取的反映植物次生代谢产物整体化学组成的特征性成分。芫花根石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物的1H NMR图谱既显示出瑞香属种间的共有成分,亦显示出芫花特有成分,因而可视为特征性标准提取物。
植物药HNMR指纹图谱的特征性和专属性除了揭示同种不同产地或同属异种总成分质和量的差别外,还为相同药材不同试剂分级提取物之间提供了质和量判定的依据。本研究采用质子共振峰的相对积分面积表示质子共振信号强度,考察了不同试剂分级提取物的1H NMR指纹图谱。结果表明以相同内标参比的质子化学位移共振信号积分面积具有可比性。两种试剂分级提取系统各级提取物的HNMR指纹数据出现类似的变化规律,即高场区质子信号共振峰的相对积分面积随着提取溶剂极性的增加迅速减少,而苷类化合物糖基质子共振峰积分面积(3.0～3.8 ppm)、芳环羟基共振峰积分面积(8.0～13.4)则迅速增加。提取物1H NMR质子共振峰积分面积随提取溶剂极性不同呈现的规律性变化,可为芫花根定向提取工艺的研究,提供快速可靠的检测方法。
参考文献:
[1] 郑维发,石枫,王莉,等.芫花根醇提物弱性极组分化学成分及其抗炎活性研究[J].解放军药学学报, 2004,20(1):18-22.
[2] 马天波,刘思贞,徐国永,等.芫花条化学成分的研究[J].中草药,1994,25(1),729.
关键词:芫花根;HNMR指纹图谱;分级提取
摘要:目的:建立芫花根的HNMR指纹图谱,以揭示其次生代谢产物类别的组成,为芫花根有效成分脱毒提取工艺的研制提供检测手段。方法:以CDCl3/DMSO-d6 为溶剂,在25℃测定芫花根石油醚-丙酮-甲醇提取物HNMR图谱。各质子共振信号强度以相对积分面积表示。用HNMR图谱考察石油醚→丙酮→甲醇和氯仿→乙醚→乙酸乙酯→甲醇两个分级系统芫花根的各级提取物化学组成的变化。结果:芫花根HNMR指纹图谱出现了长链烃或二萜原酸酯的质子、芳环质子、吡喃糖基质子以及多个羟基共振信号,提示芫花根中存在二萜原酸酯或长链烃类、黄酮和香豆素等芳香族化合物。不同分级溶剂提取物的1H NMR有显著差异。随着分级提取溶剂的极性增加,高场区质子信号强度迅速减弱,低场区羟基信号、糖基质子信号强度迅速增加。结论:芫花根HNMR指纹图谱具有特征性和专属性,可作为芫花根有效成分脱毒提取工艺研究提供简便可靠的检测方法。
芫花(Dephne genkwa Sieb et Zucc)为瑞香科植物,广泛分布于我国长江流域各省和黄河流域的部分地区。芫花根具有消炎、镇痛、镇静及抗惊厥等多种药理作用。研究表明,芫花根中主要含有黄酮、香豆素和萜类化合物。其中黄酮类化合物除了芫根苷等少数单黄酮外主要含有daphnodorin系列双黄酮,种类多且含量高,为芫花根皮中主要成分之一。香豆素类化合物主要有伞形花内酯,西瑞香素等及其苷类化合物,为芫花根另一类主要成分。这两类化合物种类多、含量高,构成了芫花次生代谢产物的主体。芫花根中另一类代表性成分为二萜原酸酯类,该类成分具有强烈的刺激性,对皮肤、黏膜系统有较大的毒害作用,是芫花根抗生育的有效成分,也是芫花根特征性有毒成分。由此可见,芫花根药理活性成分与有毒成分同时并存。如何以最经济的方式去除芫花根有毒成分,最大限度地保留药理活性成分已成为芫花根提取工艺的关键。建立芫花根指纹图谱对研制芫花根脱毒提取工艺或其有效成分定向提取工艺具有指导意义。我们在得到芫花根黄酮、香豆素和二萜原酸酯类等特征化合物的基础上建立了芫花根HNMR指纹图谱,测定并解析了芫花根不同溶剂提取物的1H NMR图谱,运用芫花根HNMR指纹图谱观察了各级提取物中各类次生代谢产物组成的变化。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
芫花根于2002年3月采于安徽省南部山区,生药经南京中医药大学叶定江教授鉴定,室温自然风干。硅胶(青岛海洋化工厂) 、Sephadex LH-20。核磁共振波谱仪(Bruker AV400) 、HP5973型质谱仪、紫外波谱仪(Genesys 2) 。1. 2 方法
1. 2. 1 特征化合物的分离及鉴定
取芫花根2kg,石油醚2丙酮2甲醇(1∶1∶) 80℃回流24 h,提取物以硅胶柱色谱分离,石油醚-丙酮(100∶0～1∶
1)梯度洗脱,得化合物1以及8个组分。组分3经多次硅胶柱层析(氯仿2丙酮, 6∶4)得化合物2和3;组分4经Sepha
dex LH-20凝胶柱层析得化合物4;组分5反复经Sephadex LH-20凝胶柱层析得3个黄色针状晶体(化合物5,6,7)以MS、HNMR、CNMR、H-H COSY、HSQC和NOESY等光谱学方法鉴定化合物分子结构。
1. 2. 2 不同溶剂分级系统的提取物制备
取芫花根150g,其中50g以石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)80℃水浴回流1h; 50g以氯仿→乙醚→乙酸乙酯→甲醇
按先后顺序分别在80 °C水浴分级回流提取1h; 50g以石油醚→丙酮→甲醇按先后次序分别在80℃水浴分级回流提取1h。提取液经浓缩碱压干燥,于硅胶干燥器中保存。
1. 2. 3 各级提取物HNMR谱图测定
取石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物100mg,各试剂分级提取物取50mg,溶解于0.5mL 的CDCl3、DMSO-d6(1∶1)混合试剂,于25℃测定各级提取物的HNMR。HNMR中各质子共振信号参照2.508mg/g DMSO-d6中甲基峰面积进行积分,以得到的相对积分面积表示质子共振信号强度。
2 结果
2. 1 特征化合物的光谱学数据
化合物1浅黄色针晶(氯仿-甲醇= 1∶1) ;m.p.244～247℃;UV (MeOH)λmax:229,265,325,343nm; ESIMS (m /z) ; 353.1317[M+H]+; HNMR(400MHz,CDCl3∶MeOD-d4= 2∶1):δ11.60(1H,s,OH) ,8.05 (1H,d,J=9.2 Hz, H-4)，7. 86(1H,s,H-4),7.70(1H,d,J=8.4Hz,H-5),7.22(1H,s,H-5),7.18(1H,d,J=2Hz, H-8),7.09(1H,dd,J=8.4,2Hz, H-6),6.78(1H,s,H-8),6.38(1H,d,J=9.2Hz,H-3),3.81(3H,s,OCH3 );13CNMR(100MHz, CDCl3:MeOD-d4=2∶1) :δ160.0(C-2),159.8(C-2),157.1(C-7),154.9(C-9),150.3(C-7),147.6(C-9),145.7(C-6) ,144.0(C-4),135.6
(C-3),131.0(C-4),129.1(C-5),115.0(C-10),113.8(C-3) , 113.4(C-6), 110.2(C-10),109.4(C-5),104.0 (C-8),102.6(C-8),56.0(OCH3)。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物2为西瑞香素。
化合物2棱柱状晶体(甲醇);m. p.205～207℃;ESIMS(m/z):649.1381[M+H]+; 1HNMR(400MHz,CDCl3):δ8.05～7. 85(2H,m,Bz-2H),7.70～7.30(3H,m,Bz-3H),7.53(1H,br.s, J = 1.6Hz, H-1),6.63 (1H,dd,J=16,9.6Hz,H-23) , 6.30～5.40(2H,m,H-24,H-25),5.60(1H,dd,J =16,3.2Hz,H-22),5.15(1H,s,H-12 ),4.96(2H,br.s.,J=0.4Hz, H-16),4.86(1H,d,J=3.2Hz,H-14),4.12(1H,d,J= 4Hz,H-5),3.96(1H, s, 52OH),3.80 (1H, br. s. , H-10) ,3.77 (2H,s,H-20),3.57(1H,d,J=3.2Hz,H-8),3.55(1H,s,4-OH),3.54(1H,s,H-7),2.50(1H,q,J=6.8Hz,H-7),2.29(1H, br.s,20-OH) , 2.05(2H,q,J=6.8Hz,H-26),1.80(3H,br.s,J=0.4Hz,H-17),1.48( 3H,br.s, J=1.6Hz,H-19),1. 33(3H,d,J=7.Hz,H-18),1.29(6H,m,H-27,H-28,H-29),0.86(3H,t,H-30)。数据与文献报道的结果完全一致,故化合物3为yuanhuadine。
化合物4 黄色针晶(氯仿);ESIMS(m/z):163.1251[M+H]+;HNMR(400MHz,acetone-d6):δ10.18(1H,s,OH),7. 87(1H,d,J=8.8Hz,H-4),7.45(1H,d,J=8.4Hz,H-5),6.70(1H,dd,J= 8.4,2.4Hz,H-6),6.65(1H,d,J=2 4Hz, H-8) , 6.13(1H,d,J=8.8Hz,H-3);13CNMR ( 100MHz,acetone-d6):δ161.7(C-7),160.8(C-2),156.1(C-9),144.7 (C-4) , 130.1(C-5),113.5(C-6),111.6(C-3,C-10)102.8(C-8)。数据与文献完全一致,因此,鉴定化合物4为伞形花内酯。
化合物5 浅黄色无定形粉末;UVλmax (MeOH):330,297,284,228nm; ESIMS(m/z):559.1246[M+H]+;HNMR (400MHz,CDCl3:MeOD-d4=1∶2):δ11.55( 1H,s,OH),10.09(1H,s,OH),9.13(1H,s,OH),8.79(1H,s,OH),8.47 (1H, s,OH),7.36(2H,d,J=8.4Hz,H-2Ê, H-6Ê) ,7.03 (2H,d,J=8.4,H-2, H-6′),6.80(2H,d,J=8.4Hz,H-3Ê, H-5Ê) , 6.73(2H,d,J=8.4Hz,H-3′, H-5′),6.28(1H, s,H-6),6.04( 1H,d,J=2Hz,H-6″),5.76(1H,d,J=2Hz, H-8″) , 5.38(1H,s, 3″-OH),4.72(1H,d,J=6.8Hz,H-2),4.26(1H,d, J=4.8Hz, 3-OH),3.90 (1H,m,H-3) , 2.80 (1H,dd, J=16.4,5Hz,H-4a),2.62( 1H,dd,J=16.4, 7.6Hz, H-4b) ;13CNMR (100MHz, CDCl3 :MeOD-d4 = 1∶2):194.4 (C-4″) ,168.2 (C-7″) ,164.7 (C-5″) ,162.9 (C-9″),161.4(C-7),159.5(C-5),158.9 (C-4Ê),157.9(C-4′), 153.4(C-9),130.3 (C-1′),129.7(C-2Ê,C-6Ê),128.5 (C-2′, C-6′,),126.2 (C-1Ê) ,118.2 (C22″) , 116. 1(C-3′, C-5′),115.4 (C-3Ê, C-5Ê),103.8(C-10),107.9 (C-8),99.8(C-10″),97.6(C-6″),95.6(C-8″) , 91.9(C-6),81.8(C-3″),81.7(C-2),67.7(C-3),28.2(C-4)。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物5为Daphnodorin G。
化合物6 黄色针状晶体(甲醇);m.p.215 ～217℃;UVλmax (MeOH);308,215nm;ESIMS(m/z):543.1119[M+H]+; H NMR(400MHz,CDCl3:MeOD-d4=1∶2):δ12.40(1H,s,OH),11.10(1H,s,OH),10.40(1H,s,OH),9.61(1H,s,OH),9. 54 (1H,s,OH),9.17(1H,s,OH),7.24(2H,d,J=8.4Hz, H-12″, H-16″) ,6.81( 2H,d,J=80Hz,H-2, H-6′),6.73 (2H,d,J=8.4Hz,H-13″,H-15″),6.62 (2H,d,J =8.0Hz, H-3′, H-5′),6.61( 1H,s,H-6),5.67(2H,s,H-7″, H-
9″),5.01(1H,d,J=5.2Hz,3-OH),4.61(1H,d,J=7.6Hz,H-2),3.70(1H,m,H-3),2.70 (1H,dd,J=16,5.6Hz,H-4a) ,
2.52(1H,dd,J=16,8.6Hz,H-4b) ; 13 CNMR ( 100 MHz,CDCl3 :MeOD-d4 = 1∶2):80.4(C-2),66.3(C-3),28.4(C-
4),153.4(C-5 ),89.6(C-6),141.3(C-7),106.0(C-8),152.4(C-9),103.2( C-10 ),129.0 ( C-1′),127.1( C-2′),114.3 (C-3′),157.2 (C-4′),114.3 (C-5′),127.1 (C-6′),146.7 (C-2″),117.1 (C-3″),194.2(C-4″),105.9 (C-5″),164.2 (C-6″),94.4(C-7″),165.4 (C-8″),94.4(C-9″),164.2(C-10″),121.3(C-11″), 126.5 (C-12″),115.4 (C-13″),156.1(C-14″),115.5(C-15″),126.5(C-16″) 。数据与文献报道的结果一
致,故化合物6鉴定为Daphnodorin B。
化合物7 浅黄色针晶(甲醇);UV(MeOH)λmax:268,295,336nm; ESIMS (m/z):285.1035 [M+H]+;HNMR(400MHz,MeOD-d4):δ13.07 (1H,s,5-OH),10.38 (1H, s, 4’-OH) ,7.93 ( 2H, d, J=8.4Hz, H-2 ’, H-6 ’),7.07 ( 2H,d,J =8.4Hz,H-3’, H-5’),6.87(1H,s,H-3),6.65(1H,d,J=2.4Hz,H-8),6.36(1H,d,J=2.4Hz, H-6),3.88(3H,s,OCH3);CNMR (100MHz,MeOD-d4):δ180.5(C-4),165.0(C-7) ,164.1(C-2),161.2(C-5),161.1 (C-4 ’),157.0(C-9),128.3(C-2’,C-6’) ,121.0 (C-1’),115.9 (C-3’, 5’),104.6(C-10),102.8(C-3) , 98.0(C-6),92.5(C-8),56.1(OCH3) 。数据与文献所报道的完全一致,所以鉴定化合物7为Genkwanin。
2. 2 特征化合物1H NMR波谱学特点
化合物1、4芳环质子信号集中在6～8.3ppm之间。质子被甲氧基取代,甲基共振信号出现在4.0～3.7ppm之间,质子被羟基取代,则羟基活泼氢信号多出现在8～13.4ppm之间。化合物5、6、7芳环质子信号也集中在5.5～8ppm之间,其中,daphnodorin系列双黄酮( 5、6)的吡喃环内H-2在4.5～4.9ppm之间出现特征性的d峰(J=7.6) 。若H-3位为-OH取代,则另一质子信号出现在3.7～3.9ppm之间,信号被裂分成多重峰。H-4则在2.56～2.7ppm出现dd峰(J=16,8.6)。芳环羟基信号出现在8.4～13.6ppm的低场区。化合物2、3在高场0.86、1.29ppm出现二萜原酸酯类化合物中长链酯类特征信号; H-20在3.77ppm有一特征性的羟甲基单峰信号;H-16在4.96ppm处有一特征性的末端次甲基加宽峰。
2. 3 芫花根HNMR指纹图谱
石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)混合溶剂是集弱极性、中大极性为一体的溶剂体系。根据相似相溶的原理,该溶剂体系提取物的总成分基本能够反映芫花根次生代谢产物的总成分。因此,将石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物作为芫花根HNMR指纹图谱的研究对象。芫花根总成分HNMR图谱从高场0.75～0.9ppm出现了与次甲基邻偶的末端甲基信号群,积分面积为1.30;1.29ppm左右出现了典型的多个次甲基邻偶信号,积分面积为10.65。提示芫花根中存在二萜原酸酯或长链烃类化合物。低场区8.0～13.6ppm出现了众多的羟基信号积分面积达4.53; 6.5～8.0ppm之间出现密集的芳环质子信号,总积分面积达6.26。这些信号表明芫花根次生代谢物中含有多种黄酮和香豆素等芳香族化合物。4.0～5.2ppm之间出现了密集的质子d峰信号,其中在4.6ppm左右出现了两个强度较大d峰。
2. 4 芫花根不同分级提取物的HNMR图谱
这些信号系daphnodorin双黄酮吡喃环H22的特征信号, 2.4～2.8ppm 出现强度较弱的多组质子共振信号,为daphnodorin双黄酮吡喃环H-4的特征信号。这些信息表明,daphnodorin系列的双黄酮是芫花根次生代谢产物中的主要成分之一。在5.21ppm处有一很强的d峰信号,为吡喃糖H-1特征信号,同时3.0～4.0ppm之间出现总积分面积达17.59的吡喃糖基质子信号群,表明芫花根有含量很高的苷类化合物。
2. 4. 1 石油醚→丙酮→甲醇分级提取的芫花根HNMR图谱
该溶剂顺序分级提取的各级提取物HNMR指纹图谱呈现一定规律的变化。石油醚一级提取物HNMR图谱0.86ppm的末端甲基相对积分面积达26.01。1.29、1.65、2.25ppm处的次甲基相对积分面积分别为157.40、16.07和12.47。表明石油醚一级提取物主要含有弱极性的长链烃和二萜原酸酯类化合物。丙酮二级提取物的HNMR图谱在0.86、1.26ppm处的质子相对积分面积分别下降到2.20和7.79,表明经过石油醚的提取,长链烃和二萜原酸酯类化合物含量已有很大的降低。该提取物在4.5～5.10ppm之间出现了多个daphnodorin系列双黄酮吡喃环H-2的特征信号, 6.51～7.20ppm出现密集芳氢质子信号,结合在8.0～13.4ppm出现的多数羟基信号可以判定丙酮在80℃时对芫花根双黄酮、香豆素或其他酚类化合物有很强的萃取力。甲醇3级提取物HNMR图谱0.86、1.26ppm的相对积分面积分别减至0.18和0.45。说明经过2级提取芫花根弱极性成分包括有毒的二萜原酸酯类含量已大大降低。该级提取物HNMR图谱在2.4、2.56ppm出现了daphnodorin系列双黄酮H-4的dd峰特征信号,4.0～5.03ppm之间出现众多
daphnodorin系列双黄酮H-2特征的d峰。表明该级提取物中含有daphnodorin系列双黄酮。在3.0～3.8ppm之间出现密集的吡喃糖基的质子信号, 5.21ppm出现了吡喃糖基H-1特征宽单峰。这些质子共振信号表明,该级提取物中还含有含量较高的苷类(黄酮苷或香豆素苷)化合物。
2. 4. 2 氯仿→乙醚→醋酸乙酯→甲醇分级提取的芫花根HNMR图谱
该溶剂顺序提取的各级提取物1H NMR指纹图谱也呈现出类似的变化规律。弱极性成分如长链烃、二萜原酸酯类化合物主要集中在氯仿一级提取物中。乙醚二级提取物中开始出现daphnodorin系列双黄酮、香豆素类化合物的共振信号,乙酸乙酯三级提取物中除了出现daphnodorin系列双黄酮的特征共振信号外,在3.0～3.8ppm之间、5. 21ppm还出现吡喃糖基的质子特征共振信号,说明daphnodorin系列双黄酮和苷类(黄酮苷或香豆素苷)化合物是该级提取物中的主要成分。甲醇4级提取物与醋酸乙酯3级提取物成分相似,但甲醇4级提取物中含有含量更低的二萜原酸酯类化合物和含量更高种类更多的苷类化合物。
3 讨论
次生代谢产物是植物药具有药理作用的物质基础。植物药总提取物的HNMR指纹图谱反映其化学成分的结构和相对组成方式。多种不同极性溶剂以固定的比例组成混合溶剂,在80℃对植物中多种不同极性的次生代谢产物具有很强的萃取力。由此获得的植物总提取物可视为植物次生代谢产物的整体化学组成。本研究以石油醚2丙酮2甲醇作为提取溶剂在80℃对芫花根回流提取1h,得到的HNMR图谱显示提取物中含有弱极性的长链烃和二萜原酸酯,中等极性的黄酮、香豆素等芳香族化合物和大极性的苷类化合物。基本反映了芫花根次生代谢产物的整体组成及其特征性成分。有作者认为植物药HNMR指纹图谱要以特征的标准提取物为研究对象,以显示同属种间和同种不同产地的差异。所谓特征性的标准提取物是指以标准的提取分离手段从植物药中获取的反映植物次生代谢产物整体化学组成的特征性成分。芫花根石油醚-丙酮-甲醇(1∶1∶1)提取物的1H NMR图谱既显示出瑞香属种间的共有成分,亦显示出芫花特有成分,因而可视为特征性标准提取物。
植物药HNMR指纹图谱的特征性和专属性除了揭示同种不同产地或同属异种总成分质和量的差别外,还为相同药材不同试剂分级提取物之间提供了质和量判定的依据。本研究采用质子共振峰的相对积分面积表示质子共振信号强度,考察了不同试剂分级提取物的1H NMR指纹图谱。结果表明以相同内标参比的质子化学位移共振信号积分面积具有可比性。两种试剂分级提取系统各级提取物的HNMR指纹数据出现类似的变化规律,即高场区质子信号共振峰的相对积分面积随着提取溶剂极性的增加迅速减少,而苷类化合物糖基质子共振峰积分面积(3.0～3.8 ppm)、芳环羟基共振峰积分面积(8.0～13.4)则迅速增加。提取物1H NMR质子共振峰积分面积随提取溶剂极性不同呈现的规律性变化,可为芫花根定向提取工艺的研究,提供快速可靠的检测方法。
参考文献:
[1] 郑维发,石枫,王莉,等.芫花根醇提物弱性极组分化学成分及其抗炎活性研究[J].解放军药学学报, 2004,20(1):18-22.
[2] 马天波,刘思贞,徐国永,等.芫花条化学成分的研究[J].中草药,1994,25(1),729.
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