甄攀，张万明，白雪梅，王治宝，王德宝
摘要:目的建立吴茱萸水溶性成分的HPL(:指纹图谱，为鉴定吴茱萸药材提供依据。方法：
色谱柱:YWG-C18(250mmx 4.6mm,10μm)，流动相:乙睛-0.4%磷酸梯度洗脱，流速:0～8min为1.0m L/min,8～20min为0.5ml/min,20～35min为1.0mL/min，检测波长327nm，柱温30℃，进样量20μL。结果测定的10批吴茱萸样品有15个共有峰，共有峰相对保留时间的RSD为0.24%～1.3%，相对峰面积的RSD为11.8%～59.3%. 10批样品之间的重叠率均在0.80以上，共有峰占总峰面积均约在90%。结论本实验首次建立了
中药吴茱萸中水溶性成分的HPLC指纹图谱，为吴茱萸药材的真伪鉴别提供了
科学依据。
关键词:吴茱萸;水溶性成分;指纹图谱;绿原酸
由于受产地、
气候和生态
环境等的影响，中药材中主要成分差异较大，仅针对其中某一个成分进行定性定量分析，并不能有效地控制中药材或中成药的质量。目前，指纹图谱已成为国际公认的控制中成药和天然药物质量的有效手段。指纹图谱是指某种(或某产地)中药材或中成药中所共有的、具有特异性的某类或数类成分的色谱或光谱的图谱。其特点在于:①通过指纹图谱的特异性，能有效鉴别样品的真伪或产地;②通过指纹图谱主要特征峰的含量或比例的制定，能有效控制样品的质量，确保样品质量的稳定性。吴茱英[Evodiar utaecarpa(J uss.)Benth ]是芸香科植物吴茱萸的干燥成熟果实，具有温胃止吐、温脾止泻、镇痛、升高体温等作用。本实验利用HPLC研究了吴茱萸中水溶性成分，制定了吴茱萸水溶性成分的HPLC指纹图谱，为吴茱萸真伪鉴别和质量监控提供依据。
1 仪器与试剂
HP1100 高效液相色谱系列，HP1100化学工作站，YWG-C18(250mmx 4.6mm,10μm)色谱柱，紫外检测器。
乙腈( 色谱纯)，乙醇、磷酸(分析纯)，水为二次蒸馏水。绿原酸对照品(中国药品生物制品检定所)。吴茱萸样品经张家口医药公司药品质检员唐风阳、我院
中医系教授韩贵清鉴定为Evodia rutaecarpa (Juss.)Benth。
2 实验方法与结果
2.1 色谱条件
流动相和流速，检测波长327nm，柱温30℃。
2.2 溶液制备
2.2.1供试品溶液制备
吴茱英药材干燥、粉碎，准确称量约2.0g，用二次蒸馏水浸泡0.5h，沸水浴提取1.5h，冷却后加乙醇至含醇量50%，静置，过滤，滤液定容至50mL。进样前用0.45μm水膜过滤。
2.2.2 对照品溶液制备
精密称取绿原酸对照品
1.2mg，用水溶解并定容为10mL。进样前用0.45μm水膜过滤。
2.3 重复性、精密度与稳定性实验
2.3.1 重复性实验
取7号样品5份，按，"2.2.1”项下方法制备供试品溶液，进样分析，进样量20μL，分别记录各色谱图中峰面占总峰面积大于等于5%的峰(共有5个峰，相对保留时间分别为0.68,0.73,0.92,1.00,1.17)的相对保留时间和相对峰面积。相对保留时间的RSD分别为0.32%, 0.27%,0.37%,0.48%和0.71%，相对峰面积的RSD分别为
1.02%,1.25%,1.53%,1.39%和1.22%。说明本实验方法具有较好的重复性。
2.3.2 精密度实验利用“2.3.1”项下一份吴茱萸供试品溶液，连续6次进样，进样量20μL，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果表明，各共有峰的相对保留时间基本一致，相对峰面积亦变化不大。单峰面积占总峰面积大于等于5%的共有指纹峰，其相对保留时间的RSD为0.28%～0.75%，相对峰面积的RSD分别为1.12%～2.38%。
2.3.3 稳定性实验
利用‘`2.3.1”项下一份吴茱英供试品溶液，分别在1,2,4,8,24,48h进样，进样量20μL，单峰面积占总峰面积大于等于5%的共有指纹峰，其相对保留时间的RSD为0.27%～0.79%,相对峰面积的RSD为2.52%～3.66%。说明供试品溶液在48h内稳定。
2.4 吴茱英药材HPLC指纹图谱的建立
取不同产地的吴茱萸药材，按“2.2.1”方法制备供试品溶液，进样并记录色谱图。实验中记录了2h的色谱图，发现40min后不再有色谱峰出现。各样品都有约30个峰，按峰高取前20个较强峰进行统计处理，10批样品有15个共有峰。湖南怀化、浙江兰溪、广西凌云产地的吴茱英色谱图。色谱图显示，某些成分的峰高变化较大，提示产地不同，一些成分的含量变化较大。实验中发现，吴茱萸中含有绿原酸，保留时间为14.3～14.4min，各共有峰保留时间与该峰保留时间之比得出相对保留时间。各共有峰面积与该峰面积之比得出相对峰面积。
2.5 重叠率的计算
重叠率是从质的角度定性地说明样品之间的相关性，重叠率利用下式计算:重叠率=两样品共有峰的2倍/两样品的峰数之和x100%,10批样品之间的重叠率。
10 批样品间的重叠率都在0.80以上，说明不同产地吴茱萸之间的相关性较高。
2.6 相似度的计算
相似度是从量化的角度讨论样品之间的相关。相似度常以夹角余弦、相关系数和欧氏距离来表示。有关运算公式见文献。本实验以10批样品相对峰面积的平均值为对照样品，各样品与其比较，利用计算机Excel软件辅助计算，得出各样品的相似度。由于无法得到10批样品的平均色谱图，选择了相似度最高的即第10批样品的色谱图作为吴茱英的指纹图谱，见图由表可知，10批样品中第7批的夹角余弦(0.9691)和相关系数(0.9373)最小，欧氏距离(0.4903)最大，亦即该批样品的质量较次。如果设置夹角余弦为0.96，相关系数为0.93，欧氏距离为0.5，则本实验10批样品都合格。根据本实验分析结果，建议实际应用中设置夹角余弦大于0.96，相关系数大于0.93，欧氏距离小于0.5为合格药品。
2.7 共有峰的面积占总峰面积的百分比
共有峰的面积占总峰面积的百分比分别为92.15%，93.15%，90.33%， 88.89%，93.63%，92.88%,93.51%,90.80%,89.04%,92.11%。非共有峰的面积占总峰面积的百分比除第4批以外均小于10%，基本符合指纹图谱的要求。
3 讨论
3.1 用吴茱萸水提液制作指纹图谱，样品预处理简单，色谱系统稳定，出峰多，给出的信息充分，色谱峰之间的分离度较好，且基线平稳，可作为鉴定吴茱萸真伪和指导用药的依据。
3.2 实验中发现吴茱萸中含有绿原酸，含量约为1%。在本实验条件下，绿原酸的保留时间为14.4min，且该峰稳定，峰形对称，响应值较高，出峰在色谱图的中间位置，因此将它作为自身内标，得到指纹图谱的相对保留时间和相对峰面积。
3.3 分析结果显示，不同产地吴茱英共有峰相对保留时间的RSD在0.24%～1.3%，重现性较高;共有峰相对峰面积的RSD为11.8%～59.3%，重现性较低。因此，用相对保留时间作为指纹图谱，可信度较高。
参考文献
[1]屠鹏飞.高效液相色谱法制定中药材和中药注射液特征指纹图谱的探讨[J].中成药，2000,22(7):516.
