高效液相色谱法应用中常见问题与处理
lionguy
（ 呼和浩特 010010；）
[摘 要] 对高效液相色谱法应用过程中常见的问题及其处理方法进行了阐述。
[关键词] 液相色谱法，问题及处理
1.对流动相的要求
1.1应使用色谱纯的液体试剂配制流动相，固体试剂至少使用优级纯。流动相配制后应立即使用，时间久了(超过2天)，不宜再用；特别是加有缓冲盐的流动相，过久的贮存会导致其内部生长肉眼看不见的细菌，若仍然使用它，大量的菌丝体就会附着在色谱柱内，将大大缩短色谱柱的使用寿命。
1.2高纯水也应该使用新鲜制备的，否则回出现与1.1同样的问题。高纯水是将饮用水经过二次处理(其中至少一次是蒸馏)的水，高纯水中若含有极微量的无机离子杂质，就好像流动相中含有的缓冲盐一样，通常对检测结果不产生不良影响。高纯水中若存在有机物杂质，当时对检测好像也没有什么影响，当日积月累的杂质吸附达到饱和时，在以后某次检测中就有可能发生吸附杂质的脱落，引起“鬼峰”现象，如果“鬼峰”叠加到了组分的吸收峰上面，就会出现不准确的检测数据。
1.3当使用酸性的缓冲盐流动相时，在pH为7左右时，首选磷酸盐缓冲溶液作为流动相，因其缓冲范围是pH=6.1～8.1；其次可选择醋酸盐缓冲溶液作为流动相，其缓冲范围是pH=3.8～5.8。当样品的检测波长在210nm附近时，不可使用含有醋酸或柠檬酸的缓冲液做流动相，因其本身在210nm波长处具有一定的吸收[1]。
1.4当检测的样品比较多时，所使用的流动相应一次性足量配制完成，避免在检测过程中由于添加流动相，而造成被测组分峰面积的变化及保留时间的漂移。
1.5流动相在使用前均应进行脱气处理，避免溶解在其中的气体影响基线的稳定性和检测的灵敏度。
2.流路中流动相的存放
2.1如果当天使用的是甲醇－水混合流动相系统，而且，次日仍然使用该流动相系统。检测结束后用该流动相继续冲洗色谱柱后，就可以关机。
2.2如果在反相色谱法中使用了其他有机流动相或者是使用了加有缓冲盐的流动相，检测结束后应该首先用适当的溶剂清洗色谱系统；溶剂的选择、置换与混合请参考下表。
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不可互相置换的溶剂组 |
可能发生的问题 |
应采取的措施 |
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水与低极性溶剂（正己烷、氯仿等） |
乳浊、分层 |
先用异丙醇或丙酮置换 |
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缓冲溶液与有机溶剂（甲醇、乙腈、四氢呋喃） |
析出沉淀 |
先用水置换 |
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稀硝酸和乙醇 |
发生反应 |
先用水置换 |
各个通道用所选择的溶剂冲洗干净后（每个通道冲洗20～30分钟，柱压高时需要增加冲洗时间），最后再用甲醇冲洗，洗净后（柱压很稳定时）就可以关机。
2.3仪器长时间不使用时，若使用过正相色谱法，色谱流路中用正己烷保持；若使用过反相色谱法，一定要在各个流路中用甲醇保持，切忌在流路中长时间存在乙腈或高纯水。有乙腈存在的流路中，乙腈会对比例阀中单向球阀的橡胶衬垫产生溶涨作用，致使其黏性增大并吸附流动相中微量的纤维丝等异物，久而久之会造成单向阀密封垫的不严密，引起比例阀不能够按照设定的比例对各流路通道的流动相进行混合，由此导致基线的波动。同理，也不能用高浓度（85%以上）的乙腈做流动相；例如，当使用25%的乙腈和75%的缓冲盐混合溶液作为流动相时，应将两者混匀后再使用，切忌在两个流路通道上利用比例阀来进行混合调配，否则，也会发生上述现象。高纯水在流路中长时间存在时，会引发细菌的生长。
3.色谱柱的使用与保护[2]
3.1安装色谱柱时，注意色谱柱的标示箭头方向应与流动相的流向一致。
3.2新购进的色谱柱不宜直接使用，应该在断开色谱柱与检测器的连接，用适宜的溶剂充分冲洗并使冲洗液直接流入废液瓶，洗净后再与检测器连接和使用。用同样的方法可以冲洗被污染的色谱柱，被污染的反相色谱柱用一般的溶剂冲洗不净时，可用含THF的溶剂进行冲洗；被蛋白质类污染的色谱柱用一般的溶剂冲洗不净时，可用含DMSO的溶剂进行冲洗。
3.3在使用色谱柱之前，要仔细阅读色谱柱的说明书，使用时柱压不可以太高。通常柱压不超过最高允许柱压的4/5，柱压过高时，会引起色谱柱内部填充物的塌陷，造成死体积，在以后的检测中会经常出现色谱峰的分叉现象。
在实际工作中，当柱压过高时，应及时关闭输液泵并检查是否柱头发生堵塞，必要时更换预柱的滤芯；也可以采用降低流速或改变流动相比例等方法进行处理。若压力显示过低或压力波动无法进行分析时，应检查各流路中的气泡是否已经全部排除，各连接处有无漏液，purge阀是否已经关闭等，排除故障后方可继续操作。
3.4要注意色谱柱的使用温度，对于十八烷基键合硅胶色谱柱而言，使用温度不得超过60℃，温度过高时，会引起十八烷基碳链的断裂而损坏色谱柱。
3.5要注意色谱柱使用的pH值范围，硅胶是聚合态的硅酸，它在酸性条件下比较稳定，十八烷基键合硅胶色谱柱应该在2～7.5的pH值范围内使用，在碱性条件下，构成硅胶的硅酸单体会发生溶解（生成硅酸盐）而流失，导致色谱柱的损坏。
3.6使用液相色谱仪测定样品时，待测样品溶液在进样前必须用0.45μm的滤膜过滤，否则其中的固体或大分子杂质很容易堵塞色谱柱。另外，在色谱柱之前还应该加一个预柱，以保护色谱柱，并经常更换预柱芯。特别是检测药物残留或进行药物代谢动力学研究时（样品是经过处理的动物组织、血液或尿液，其中含有蛋白质大分子）更应该小心。
3.7分析结束后应及时清洗色谱柱，正相色谱柱用甲醇∶氯仿（1∶1）、乙酸乙酯冲洗，正己烷保持；反相色谱柱参考2.2进行处理，甲醇保持。
3.8每间隔3个月，断开色谱柱的连接，用60℃的高纯水(在purge状态下)对各个管路进行高速冲洗，以达到清除吸附的杂质和养护前段流路的目的；对于检测器部分的流路可用10%稀硝酸进行冲洗，冲洗干净后，按3.7进行保持。
4.脱尾现象的原因及解决的方法
4.1检查柱效：可以按照该色谱柱说明书中介绍的方法进行验证，如利用取代蒽、苯酚、水杨酸等标准品溶液进行试验[3]，如果并不拖尾，说明该色谱柱的柱效没有问题，应寻找其他原因。如果标准品也发生严重的拖尾，那就是柱子本身的问题了，若柱子已经吸附了大量的杂质，它运行时柱压会很高，若通过洗脱及再生的方法都不能够使之恢复，那就只能淘汰。
4.2检查流动相是否存在问题：在色谱柱中的硅胶表面，每平方纳米有6个硅醇基可供化学键合，但由于C18烷基键合基团空间位阻的存在，使得这些硅醇基不能全部参加化学键合反应[2]。例如，Partisil 5-ODS(octadecylsilane)色谱柱，未被C18烷基键合的硅醇基空位占2%，此时该柱以分配色谱占主导；Partisil 10-ODS色谱柱，未被C18烷基键合的硅醇基空位占50%，此时该柱既有吸附色谱又有分配色谱；当色谱柱填充料中存在少量未被C18烷基键合的硅醇基空位时，也容易出现拖尾，此时若是检测的药品带有碱性基团，请在1000ml流动相中加入0.7ml左右的三乙胺或三乙醇胺，它可以键合这些空位，而起到扫尾作用；若是检测的药品带有酸性基团，请在1000ml流动相中加入接近1ml的醋酸，它也能够起到相同的作用。
4.3若样品中的杂质峰和被测定组分的峰没有完全分开，也有可能被误认为是拖尾。此时，可利用改变柱长、改变流动相的组成比例或提高柱温（不得高于60℃）等方法解决此问题。
5.色谱柱的再生[3]
对于堵塞或吸附杂质较为严重的色谱柱，可以进行再生处理，方法是：
5.1反相色谱柱（流动相极性大于固定相极性）：以甲醇－水（95∶5，体积比）、纯甲醇及一氯甲烷等为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒，每种流动相的冲洗体积应20倍于柱体积；然后，再以相反的顺序依次冲洗。
5.2正向色谱柱（流动相极性小于固定相极性）：以严格脱水的正己烷、异丙醇、一氯甲烷及甲醇为流动相，依次冲洗，顺序不得颠倒，其他步骤同5.1。
参考文献
[1]靳建中.如何正确使用高效液相色谱仪[J].内蒙古科技与经济,2006,20:9～10.
[2]刘迎贵,方俊天,韩漠等.兽药分析检测技术[M].北京:化学工业出版社,2007.230-235.
[3]孙毓庆,王延琮,方群等.现代色谱法及其在药物分析中的应用[M].北京:科学出版社,2005.253-254.
