第五十八期 抗体药物异构体的HPLC色谱柱分析

抗体药物异构体的HPLC色谱柱分析

抗体药物的开发是目前全球生物技术产业的热点，在生物制药领域占有极其重要的地位，被认为是目前生物医药研发的主流方向之一。目前在世界销售额前10位的生物药物中，抗体药物就占了4个。

单抗药物由于具有靶向性强、半衰期长、副作用小等优点，在治疗重大疾病方面受到重视。单克隆抗体是一种生物大分子，由多个氨基酸组成，结构复杂，在细胞培养、纯化、储存过程中易发生化学修饰如糖基化、磷酸化、化学降解等，所以需要多种方法进行检测分析。

高效液相色谱法（HPLC）可以对抗体药物以及重组蛋白等蛋白药物的不均一性进行有效的分析。多种色谱分析方法的有效组合，能够更好地进行蛋白药物的定量和定性分析。例如，分子尺寸排阻色谱法（SEC）可以利用分子尺寸的不同，对多聚体、片段、PEG化蛋白等样品进行有效的分析；离子交换色谱法（IEC）、疏水作用色谱法（HIC）、反相色谱法（RPC）、正相色谱法（NPC/HILIC）可以对带电异构体、构造异构体、糖基化、脱酰胺化及氧化等变化引起的杂质进行高分辨率、高效分析。分离选择性取决于色谱分离模式、色谱柱的种类和色谱条件等。

以下对抗体药物异构体的HPLC分析，进行简单的介绍。抗体药物的高效液相色谱分析的分离模式，主要有以下几种：

一、尺寸排阻色谱法（SEC）--根据分子尺寸的不同，对多聚体、分解片断进行分析。

常用的柱子是TSKgel G3000SWXL。TSKgel SW 型色谱柱属于硅胶基质色谱柱，键合了亲水性二醇基官能团以保护硅胶表面不与蛋白样品相互作用。与其他竞争产品比较，SW型色谱柱单位柱体积的孔隙容量更大，能产生更高的分子量选择性范围和更高的分辨率。低吸附作用和均匀的孔径分布能实现蛋白质的高效分离。

1. 抗体多聚体的SEC分析

2. 胃蛋白酶酶解抗体的过程跟踪

3. 单抗PEG化的分析(PEG:5 kDa)

4. 半抗原结合抗体片段的分析

二、离子交换色谱法（IEC）--根据带电性的不同，对氨基酸残基的不同、脱氨基化、N末端和C末端的变化进行分析。 

离子交换介质的表面构造如下图：

常用的柱子是TSKgel CM-STAT。TSKgel STAT系列为生物高分子（蛋白质，多肽，核酸）分离用的聚合物系离子交换色谱柱。使用非多孔性填料，在通用HPLC系统中可实现超高速、超高效分离。

1. 抗体药物IEC分析实例1（单抗带电异构体的分析）

2. 抗体药物IEC分析实例2（C末端赖氨酸残基的酶处理）

3. 抗体药物IEC分析实例3（Asn脱酰胺化及异性化分析）

三、疏水相互作用色谱法（HIC）--根据立体构造（疏水性）的不同，对氨基酸残基的不同、多聚体进行分析。

常用的柱子是TSKgel Butyl-NPR。TSKgel Butyl-NPR是一款以粒径为2.5μm的，丁基键合无孔型亲水性聚合物基质为填充物的疏水作用色谱柱。适用于蛋白质、单抗、酶等生物大分子的分离分析。

1. 抗体的HIC分析实例1（使用硫酸铵作为盐淋洗液）

2. 抗体的HIC分析实例2（使用NaCl作为盐淋洗液）

3. 抗体的HIC分析实例3（脱酰胺化异构体分析）

4. 抗体的HIC分析实例4（Met氧化后的片段分析）

四、反相色谱法（RPC）--根据分子量的不同（疏水性），对氨基酸残基的不同进行分析。

常用的柱子是TSKgel Protein C4-300。色谱柱采用粒径为3μm、孔径为30nm、键合了丁基(C4)的硅胶填料充填，是一种用于分离生物大分子的高性能反相色谱分析柱。对蛋白质保留较强，分离选择性优异；对一般水溶性蛋白质的回收率高，能保持尖锐的峰形。3μm的填料粒径，可以实现高通量、高分辨率、高灵敏度的分析检测。2mm内径的色谱柱适用于LC/MS/(MS)联用分析检测。

1. 抗体的RPC分析实例1（抗体木瓜蛋白酶消化物的分析）

2. 抗体的RPC分析实例2（抗体药物二硫键还原物的分析）