HPLC测定马鞭草中熊果酸的含量

摘要：目的：建立重现性好，灵敏度高并且比较稳定的高效液相色谱法测定马鞭草中熊果酸含量，并进行方法学考察。方法：Hypersil ODS色谱柱(4.0 mm×250 into，5 pm)；柱温35℃；流动相为乙腈一0.1％ 磷酸水溶液(75：25)；流速为1.0 mL/min；检测波长为210 nm。结果：熊果酸进样量在0.624～3.120μg呈良好线性关系，平均回收率97.02％ ，RSD为0.94％(n=5)；结论：本法准确、灵敏度高、重现性好，更适用于马鞭草药材质量控制。

关键词：马鞭草  熊果酸  高效液相色谱法

    1、 仪器、样品、试剂
    AGILENT 1 100高效液相色谱仪；
    马鞭草药材购于贵阳市，经贵阳中医学院陈德媛研究员鉴定为马鞭草科植物马鞭草Verbena officina lis L．；熊果酸对照品(742—200111，供含量测定用，中国药品生物制品检定所)；乙腈为色谱纯；其他试剂均为分析纯；水为纯净水。

    2 、方法与结果
    2．1 色谱分析条件
    Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色谱柱，乙腈-0.1％ 磷酸溶液(75：25)为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35℃ ，检测波长210 nm；理论板数以熊果酸峰计算不低于4000；分离度大于1.5。
    2．2 样品测定方法
    2．2．1 对照品溶液的制备
    精密称取熊果酸对照品适量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的对照品溶液。
    2．2．2 供试液的制备精密
    称取本品粉末(过40目筛)1 g，精密加入30 mL氯仿，密塞，称定重量，超声处理1 h，放冷，再称定重量，用氯仿补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，回收氯仿至干，残渣用石油醚(30～60℃)浸泡2次，每次10mL(浸泡约2 min)，倾去石油醚液，残渣加适量甲醇使溶解，转移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，用l0.45µ m微孔滤膜滤过，即得。
    2．2．3 测定方法
    分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各5µ L，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算，即得。
    2．3 方法学考察
    2．3．1 线性关系考察
    精密称取熊果酸对照品适量，用甲醇溶解，制成每1 mL中含0.208 mg的对照品溶液，精密吸取对照品溶液3，5，7，9，11，13，15µ L依次进样，记录色谱图。以熊果酸的进样量(µ g)为横标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得回归方程：Y=452.418127X一1.1600976 r=0.9999(l=7)，结果表明熊果酸进样量在0.624～3.120 µ g范围线性关系良好。
    2．3．2 稳定性试验
    精密吸取供试液5µL，定时进样测定，时间间隔为0，2，4，6，8h测定结果依次为 3.9348，3.9439，3.9504，3.9586，3.9642 mg /g ，供试品中熊果酸含量平均值为3.9504 mg/g，RSD=0.29％ ，结果表明试验方法稳定，供试液至少在8 h内测定较稳定。
    2．3．3 精密度试验
    精密吸取供试液5µL，连续进样5次，测定结果依次为3.9088，3.9099，3.9021，3.9177，3.9064 mg/g，测得熊果酸含量平均结果为3.9090 mg/g，RSD=0.15％ ，表明精密度良好。
    2．3．4 重复性试验
    取同一批马鞭草粉末(过40目筛，按干燥品计)5份，各约1 g，精密称定，按上述方法制备供试液，测定。5份样品熊果酸平均值为3.9448 mg/g，RSD=0.71％ ，表明方法重复性良好。
    2．3．5 加样回收试验
    取马鞭草粉末(过40目筛，按干燥品计)5份，各约0.5 g，精密称定，于每份中加入1.860 mg对照品，按含量测定项制备供试液，进样，记录色谱图，计算熊果酸回收率，平均回收率为97.14％ ，RSD=0.94％ ，表明回收良好。
    2．3．6 样品测定结果
    按上述方法和色谱条件对不同产地马鞭草药材进行熊果酸的含量测定，同时采用薄层扫描法测定，测定结果显示，HPLC法的误差明显低于TLCS法。分别测定了马鞭草叶、茎中熊果酸的含量。

3 、讨论
    3．1 提取条件的选择
    熊果酸为非极性的五环三萜酸，选择甲醇、乙醇、氯仿作为提取溶剂，比较了3种提取溶剂和不同提取时间，结果甲醇、氯仿对熊果酸的提取率基本一致，均高于乙醇。由于氯仿提取物中极性较大的杂质少，测定时干扰小，故选用氯仿为提取溶剂，超声提取1.0 h，较为适宜。
    3．2分离条件的选择
    根据查阅文献资料，对熊果酸的分离多选用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；故本文选择了3种色谱柱：(1)Hypersil ODS(5 m，4.0 mm×250 mm，Agilent)色谱柱，(2)HypersilODS2(5 am，5 mm×200 mm，大连依利特)色谱柱，(3)Diam0nsi (钻石)HPLC C18(5 m，4.6 mm×250 mln，迪马公司)色谱柱；及4个流动相：(1)甲醇．水(88：12)；(2)甲醇-0.1％ 磷酸溶液(80：20)；(3)乙腈一水(80：20)；(4)乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)进行系统适用性试验。
试验结果表明：在 色谱条件：Hypersil ODS(5 m，4.0 lmTl×250mm，Agilent)色谱柱，乙腈-0.1％磷酸溶液(75：25)为流动相，流速1.0 mL/min，柱温35℃ ，检测波长210 nm，供试品中熊果酸得到较好分离，理论板数达到6000，分离R=2.20。
    3．3 检测波长的确定
    熊果酸于190～400 nm波长下扫描，最大吸收波长为195 nm，为紫外末端吸收。在210 nm波长处熊果酸吸收峰灵敏度较高，其他色谱峰干扰较小，熊果酸色谱峰的分离最为理想，故选用(210±1)nm作为检测波长。