荧光定量PCR仪技术及其在医学中的应用

　　1 概述

　　荧光定量多聚酶链式反应是一种新的核酸定量技术。该技术将荧光能量传递技术(fluorescence resonance energy transfer，FRET)应用于常规多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)仪中，从而进行定量检测。FRET即是通过受体发色团之间偶极一偶极相互作用，能量从供体发色团转移至受体发色团，转移效率与曲个发色团之间距离的6次幂倒数成比例。与普通定量PCR相比，荧光定量PCR仪具有可实时监测、准确性高、效率高等优点，本文综述目前国内外几种荧光定量PCR仪技术及应用。

　　2 荧光定量PCR 方法

　　2.1 TagMan

　　TagMan技术是利用Tag酶5 外切酶活性，即Tag酶具有天然的5 、一3 核酸外切酶活性，能够裂解双链DNA5 端核苷酸，释放出单个或寡核苷酸，裂解的最佳底物是被置换了的具有又样结构的单链DNA，水解作用发生于结合了置换部位的磷酸二酯键处。基于Tag酶的这种活性，设汁合成一个能与PCR产物杂交的探针，该探针的5 端标记一个荧光分子.3 端标记另一个荧光分子。其中3 端荧光分子能够吸收5 端荧光分子发出的荧光，因此，正常情况下该探针检测不到3 端荧光分子的荧光信号，但当溶液中有PCR 产物(模板)时，该针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而激活Tag酶5 外切酶活性，将探针5 端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏了两荧光分子间的FRET，从而发出荧光，切割的荧光分子数与PCR产物的数量成正比。因此，根据PCR反应液的荧光强度即可计算出初始模板的量。其主要不足是：

　　2.2 Molecular beacon

　　分子信标技术(molecular beacon)也是在同一探针的两末端分别标记荧光分子和淬灭分子，与Tag Man探针不同的是，该探针5 和3 末端自向形成8个碱基左右的发卡结构，此时荧光分子和淬灭分子邻近，因此不会产生荧光。当溶液中有特异模板时，该探针与模板杂交，从而破坏了探针的发卡结构，于是溶液便产生了荧光。荧光的强度与溶液中模板的量成正比。因此可用于PCR定量分析。该方法的特点是采用非荧光染料作为淬灭分子，荧光本底低 其不足之处是：(1)杂交时探针不能完全与模板结合，稳定性差;(2)探针合成时标记较复杂

　　近来，基于Molecular beacon的原理，人们对其进行改进，使用了一种发卡式引物(sunrise primer).此法能将所有扩增产物均标记上荧光分子，因此荧光信号响应快。但无法区分特异和非特异扩增是致命不足 为了克服不足，人们义对其进行改进，发明了一种称为蝎状引物(scorpion primer)的荧光定馈PCR技术。该技术在引物与Molecular beacon探针之间连接一个间隔臂，使PCR延伸反应时不能够延伸至Molecular beacon分了 这样，非特异扩增产物便无荧光信号，但当有物异扩增产物时， 即可与Molecular beacon进行分了内杂交， 产生荧光信号既解决了非特异问题，又保留了响应快的特点。但仍存在杂交时， 探针不能完全与模板匹配及合成复杂的问题.

　　2.3 Amplisensor

　　Amplisensor是一种复合探针技术，一个探针上连接一种荧光物，另一探针连接一种淬灭物。 探针长度不同，其中淬灭物标记探针5 端多出7个碱基(GCGTCCC)。PCR扩增前需将荧光物标记探针与一个半套式PCR引物连接，PCR引物的5 应有一段与长探针互补的序列. 以便连接酶将该引物与短探针连接。扩增时该探针一引物复合物作为半套式引物掺入模板，从而释放淬灭探针部分，破坏了荧光能量传递，产生荧光。荧光的强度与扩增时加入的模板数成正比。该方法主要特点：(1)采用半套式PCR扩增，提高了灵敏度，但无法区分引物二聚体形成产生的非特异扩增信号，使定量准确度受到影响;(2)每次PCR扩增前，要先进行Amplisensor的标记，增加了操作步骤和检测成本;(3)中间需加入半套式引物，增加了污染机会。

　　2.4 Lightcycler

　　Lightcycler是新近发展起来的一种定量PCR技术，该技术将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，形成发光探针和淬灭探针，发光探针的5 端与淬灭探针的3 端分别连接荧光分子。两探针设计为可与模板同一条链相邻的序列杂交，杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭的程度与起始模板的量成反比，以此进行定量分析。该方法淬灭效率高，但由于两个探针结合于模板上，因此影响扩增效率。此外，由于需合成两个较长探针，合成成本较高。

　　3 在医学中的应用

　　3.1 病原体测定

　　PCR技术的问世使病原体检测能够快速、方便地进行。由于PCR技术假阳性率太高，只要有微量病原体存在就可得到阳性结果，这并不能作为诊断依据， 只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。因此，对模板准确定量显得特别重要，应用荧光技术PCR(FQ—PCR)就能够快速、准确地得到结果。对于解决免疫学检测的“窗口期”问题，判断疾病是否处于隐性或亚临床状态，以及抗体检测不能判定是现症感染还是既往感染时，均可利用FQ—PCR进行确定。

　　一些研究资料表明，病原体感染后的发病时间，病情轻重及预后往往与病原体数量相关。如HIV感染后，潜伏期长短、临床症状轻重与血液中病毒量显著相关，甚至可根据HIV的量比较准确地预测发病时I 。在研究其他病毒感染性疾病是否有类似情况，病原体的致畸和致突变作用是否与病原体的量等有关问题时，也可利用FQ—PCR来阐明。另据研究发现，病毒的数量与某些药物的疗效相关。例如，干扰素对肝炎病毒高拷贝者不敏感，对低拷贝者敏感。因此利用FQ—PCR对某些病毒的定量分析可指导临床用药和制定治疗方案。

　　3.2 肿瘤研究

　　尽管肿瘤发病的分子机制尚未完全阐明，但相关基因的遗传学改变的积累是致癌性转变的根本原因已得到普遍承认。癌基因的表达增加和突变在许多肿瘤早期和良性阶段就可出现，FQ—PCR 不但能有效地检测基因的突变，而且能准确测定表达量，据此进行肿瘤早期诊断、分型、分期和预后判断。某些癌基因的遗传学变化的检测几乎达到确诊肿瘤的程度。例如，CD 基因的异常拼接表达，几乎只有出现于某些泌系肿瘤。对于有慢性骨髓性白血病都可检测到原癌基因易位导致的BCR/ABL融合基因形成，FQ—PCR技术不但可通过检测BCR/ABL融合基因的表达而进行肿瘤诊断，还可检测治疗中和治疗后微量残余恶性细胞存在的数量，以此作为治疗效果和估计复发的危险性的依据。

　　3.3 其他方面

　　在基因表达研究中， 由于FQ—CPR的应用，对mRNA的检测显得较以前常用的方法， 如Northem印迹、RT—PCR定量法要方便、快速、准确得多。在免疫组分析中，对免疫T细胞群体V—p组织进行分析是研究健康和疾病免疫应答反应的重要手段。利用FQ—PCR技术进行分析，克服了原来分析方法如流式细胞法、竞争性PCR技术等操作复杂，准确性低，污染严重的缺点。

　　4 结语

　　综上所述，FQ—PCR作为一种核酸定量技术，在以前的PCR技术上得到进一步发展，大大降低了假阳性率，工作效率高，结果重现性好，且不必使用对人体有害的染色剂。FQ—PCR应用较多且较成熟主要是在病原体检测方面，其优越性在此也得以充分体现。因此将其应用于临床具有很大潜力。在肿瘤、遗传病研究，尤其是基因表达方面的研究，该技术应用还较少，在这方面加强研究应用，将会有广阔的前景。将生物基因芯片技术与FQ—PCR技术结合，有助于PCR技术的进一步完善，推动该技术的发展、应用。