分子生物学实验基础

实验一 从特定质粒中扩增靶片段

第一部分 准备实验

一、介绍实验室的规章制度、注意事项

二、准备实验

1. 分组，分发实验服、试验用具

2. 准备枪头：装盒，灭菌(讲解注意点：戴手套操作)

3. 各个型号的EP管和PCR管的灭菌

4. 双蒸水灭菌

5. 洗净培养皿、摇菌小三角瓶、试剂瓶等

第二部分 利用PCR技术从特定质粒中扩增靶片段

一、实验目的

通过本实验学习PCR反应的基本原理，掌握PCR的基本操作技术以及琼脂糖凝胶电泳技术。

二、实验原理

一)引物的设计：

PCR引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。因此，引物的优劣直接关系到PCR的特异性与成功与否。

我们可以归纳十条PCR引物的设计原则：

1.引物的特异性

引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源。

2.避开产物的二级结构区

某些引物无效的主要原因是引物重复区DNA二级结构的影响，选择扩增片段时最好避开二级结构区域。

3.长度

寡核苷酸引物长度为15~30bp，一般为20~27mer。引物的有效长度：Ln=2(G+C)+(A+T)，Ln值不能大于38，因为>38时，最适延伸温度会超过Taq DNA聚合酶的最适温度(74℃),不能保证产物的特异性。

4.G+C含量

G+C含量一般为40%~60%。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式

Tm=4(G+C)+2(A+T)估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近

72℃以使复性条件最佳。

5.碱基础随机分布

引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。

6.引物自身

引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹状结构牙引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。若用人工判断，引物自身连续互补碱基不能大于3bp。

7.引物之间

两引物之间不应不互补性，尤应避免3′端的互补重叠以防引物二聚体的形成。一对引物间不应多于4个连续碱基的同源性或互补性。

8.引物的3′端

引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构可能，

9.引物的5′端

引物的5′端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5′端修饰包括：加酶切位点;标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等;引入蛋白质结合DNA序列;引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入启动子序列等。

10.密码子的简并

如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。

当然，这是PCR引物设计的一般原则，随着人们对引物的认识，一些引物的计算机设计程序也应运而生，例如Primer Premier,还可以解决特殊目的的引物设计。

二) PCR原理与体系

PCR用于扩增位于两端已知序列之间的DNA区段，即通过引物延伸而进行的重复双向DNA合成。基本原理及过程如下：

PCR循环过程中有三种不同的事件发生：

(1)模板变性;(2)引物退火;(3)热稳定DNA聚合酶进行DNA合成。

1. 变性：加热使模板DNA在高温下(94-95℃)变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链，即变性阶段。

2. 退火：在体系温度降至37-65℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，使引物与模板链3’端结合，形成部分双链DNA，即退火阶段。

3. 延伸：体系反应温度升至中温72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5’到3’方向复制出互补DNA，即引物的延伸阶段。

上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25～30个循环后DNA可扩增106～109倍。

典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两条合成的DNA引物、耐热DNA Taq聚合酶。

三) 琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解，45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。

DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。

由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。

琼脂糖凝胶电泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应：在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样， 迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。例如，一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA， 即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。

溴化乙锭(EB)为扁平状分子，在紫外照射下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA.

三 实验步骤

1 引物的处理

a) 购买回来的合成引物是粉末状的, 一般我们拿到引物后,首先8000—10000rpm离心5min,使粘在管壁上的引物粉末沉降.

b) 溶解引物.需要计算加入的溶剂(ddH2O)的量.

c) 轻轻打开EP管盖,将溶剂打入.

d) 4℃溶解1h。

2 PCR体系：

TIPS:

i. 在检验的时候，可用25ul体系;需要回收时要做50ul体系

ii. 每名同学做一个50ul体系，

25ul 体系

Template DNA: 1.0—700pg (1ul)

Primer:1：0.5umol/l (1ul)

Primer 2：0.5umol/l (1ul)

dNTP ：0.2mmol/l (1ul)

10×buffer: 5ul

Taq enzyme： 2.5U (0.5ul)

ddH2O： - (40.5ul)

PCR程序:

1) 95℃ 5min

2) 95℃ 30s

3) 55℃ 30s

4) 72℃ 2min

5) Go to 2),30 cycles

6) 72℃ 10min

7) 4℃ for ever

3 电泳检测的预备实验

配制电泳缓冲液TAE缓冲液 贮存液(L) 50×

242g Tris

57.1 ml冰乙酸

18.622g EDTA (100ml的0.5 mol/L EDTA(pH 8.0))

加水补足1 L

配制氨苄青霉素母液(50mg/ml)10ml，硫酸卡那霉素母液(60mg/ml)10ml,分装1ml，冻存。

实验二 DNA片段检测及回收

第一部分 电泳检测PCR产物

电泳

a) 配制1×电泳缓冲液，导入电泳槽

b) 洗刷干净制胶板,插好制胶孔的梳子

c) 称量: 根据你要得到的靶基因片段的大小确定琼脂糖凝胶的浓度(1%)

d) 溶解: 用电泳缓冲液溶解琼脂糖:,放在微波炉里加热,帮助溶解,注意不要沸腾.

e) 从微波炉里拿出三角瓶,把溶液倒入制胶板,等待凝固

f) 凝固后,拔掉梳子

g) 把凝胶放进电泳槽中

h) 加样

i) 插上电源,电泳(200v，250mA)

第二部分 回收PCR产物

1. 电泳，按上述操作，制作回收胶

2. 电泳后，在紫外灯下切下目的条带放入1.5ml离心管，避免在紫外灯下照射超过30秒。

3. 切下的条带放入1.5ml离心管中，按比例(1g/ml)加入结合缓冲液，55-65溶胶7min，期间轻微振荡2-3次。

4. 把回收柱放入回收管中，然后把溶解后的溶液加入回收柱中，静置2min，8000rpm，离心1min，弃去回收管内溶液。

5. 重新加入300µl结合缓冲液，10000rpm离心1min。

6. 加入500µl清洗缓冲液，静置2-3min后，10000rpm离心1min。

7. 重复步骤5.

8. 弃去回收管内的液体后，把回收柱重新放入回收管内，12000rpm再次离心1min以除去多余液体。

9. 取出回收柱，放入1.5ml离心管内，静置10min，加入20-50µl洗脱液，1000rpm离心1min，管内即为回收DNA。

10. 电泳检测回收结果

准备实验：配制制备大肠杆菌感受态的试剂和培养板

配制LB培养基：1. 称量下列试剂，置于1L烧杯中

Tryptone 10g

Yeast Extract 5g

NaCl 10g

2. 加水补至1L。

3. 高温高压灭菌后，4℃保存。

固体LB培养基：500ml，分装为2瓶

按照上面比例称量好药品，然后按照15g/L的比例加入琼脂粉，高温高压灭菌后，冷却至50℃左右加入所需抗生素或不加抗生素直接倒平板。

配制0.1M CaCl2溶液500ml，灭菌后放入4℃冰箱待用。

配制80%甘油(v/v)

实验三 制备大肠杆菌感受态

1、 感受态细胞的概念

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主(受体)细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这种导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

所谓的感受态，即指受体(或者宿主)最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积适当比例的无菌甘油或-70℃保存(有效期6个月)。

2、 转化的概念及原理

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

大肠杆菌的转化常用化学法(CaCl2法)，该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。

Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子(如Mn2+、Co2+)、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。

除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。

3、 感受态细胞制备及转化中的影响因素

⑴、细胞的生长状态和密度

最好从-70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。不要用已经过多次转接，及贮存在4℃的培养菌液。细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳。即应用对数期或对数生长前期的细菌，可通过测定培养液的OD600控制。对TG1菌株，OD600为0.5时，细胞密度在5×107个/ml左右。(应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的不同而不同)。密度过高或不足均会使转化率下降。此外，受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。并且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配。

⑵、质粒DNA的质量和浓度

用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的，转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比，但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时，则会使转化率下降。一般地，DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5%，1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞达到饱和。对于以质粒为载体的重组分子而言，分子量大的转化效率低，实验证明，大于30kb的重组质粒将很难进行转化。此外，重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关，环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍，因此重组DNA大都构成环状双螺旋分子。

⑶、试剂的质量

所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的，并用最纯净的水配制，最好分装保存于4℃。

⑷、防止杂菌和杂DNA的污染

整个操作过程均应在无菌条件下进行，所用器皿，如离心管，移液枪头等最好是新的，并经高压灭菌处理。所有的试剂都要灭菌，且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染，否则均会影响转化效率或杂DNA的转入。

⑸、整个操作均需在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率将会降低

4.操作过程：

1、挑取大肠杆菌TOP10 单克隆，在LB 固体培养基上划线培养，37°C O/N;

2、挑取单克隆，置于10 ml LB 液体培养基中，37°C，220r/min，O/N;

3、按1: 50 将菌液转接到100 ml LB 液体培养基中，37°C，220r/min，2.5-3h，此时，OD590 值约为0.4;

4、将菌液分装至10ml 预冷无菌的离心管，各加8 ml 菌液，置于冰上25min;

5、4°C，4000 r/min 离心6min，弃上清。用2ml 冰预冷0.1MCaCl2 溶液重悬菌体沉淀(冰浴中操作);

6、重复步骤5;

7、冰上放置30 min，4000 r/min 离心6min，去上清;

8、用0.4ml 冰预冷的0.1MCaCl2 溶液重悬菌体沉淀，然后按每管0.1ml 分装于

1.5 ml 的Eppendorf 管中，于4°C 保存(7d)或每管加入70μl 80%甘油，液

氮速冻，然后置于-70°C 冰箱保存(120-150d)。

5.双酶切DNA片段用于连接表达载体

使用BamHI，Hind III两个内切酶

酶切体系：50µl

23µl H2O

5µl Buffer

20µl DNA回收产物

1µl BamHI

1µl Hind III

37°C酶切过夜

酶切片段回收

酶切结束后，在反应体系中加入两倍体积的预冷的无水乙醇，冰浴沉淀2h，离心12000rpm 15min，弃去上清，再加入400µl预冷的70%乙醇洗涤沉淀，12000rpm 15min，弃去上清，离心管倒扣放置15min，加入15µl无菌水。

宝生物

Double Digestion(双酶切反应)时Universal Buffer(通用缓冲液)的使用表

说明：使用二种酶同时进行DNA切断反应 (Double Digestion) 时，为了节省反应时间，通常希望在同一反应体系内进行。TaKaRa采用Universal Buffer表示系统，并对每种酶表示了在各Universal Buffer中的相对活性。尽管如此，在进行Double Digestion时，有时还会难以找到合适的Universal Buffer。

本表以在pUC系列载体的多克隆位点处的各限制酶为核心，显示了在Double Digestion可使用的最佳Universal Buffer条件。在本表中，各Universal Buffer之前表示的 [数字×] 是指各Universal Buffer的反应体系中的最终浓度。TaKaRa销售产品中添附的Universal Buffer全为10倍浓度的缓冲液。终浓度为0.5×时反应体系中的缓冲液则稀释至20倍，1×时稀释至10倍，2×时稀释至5倍进行使用。

注意：1 μg DNA中添加10 U的限制酶，在50 μl的反应体系中，37℃下反应1小时可以完全降解DNA。

为防止Star活性的产生，请将反应体系中的甘油含量，尽量控制在10%以下。

根据DNA的种类，各DNA的立体结构的差别，或当限制酶识别位点邻接时，有时会发生Double Digestion不能顺利进行的可能。

实验四 连接及转化大肠杆菌感受态细胞

一、实验目的

通过本实验，掌握大肠杆菌感受态的基本知识、转化的方法和技术以及重组子的鉴定方法。

二 实验原理

重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主(受体)细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。

在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。

我们实验中使用的感受态是大肠杆菌感受态是TOP10(transgene)。

在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，

使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。

受体细胞经过一些特殊方法(如：电击法，CaCl2等化学试剂法)处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。

重组DNA转化受体细胞后，须在不同水平上进行筛选，以区别转化子与非转化子、重组子与非重组子以及鉴定所需的特异性重组子。在转化过程中，并非每个受体细胞都被转化;即使获得转化细胞，也并非都含有目的基因，所以需采用有效方法进行筛选。筛选的方法包括根据遗传表型筛选、限制性内切酶分析筛选、核酸探针筛选、PCR筛选等。本实验采用遗传表型筛选中的抗生素平板筛选或α互补筛选的方法。

α互补筛选的方法适用于含有半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体，如 pUC系列等，其原理是：载体含有LacZ的调控序列和N端146个氨基酸的编码信息。在这个编码区中插入了一个多克隆位点。当这种载体进入可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞后(质粒和宿主细胞编码的片段各自都没有酶活性)，它们可以融为一体，形成具有酶学活性的蛋白质，这种现象叫α互补。由α互补而产生的 Lac 细菌在呈色底物 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷(X-gal)和诱导剂异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)存在下形成蓝色菌落。当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致产生无α互补能力的氨基端片段。因此，带有重组质粒的细菌形成白色菌落。通过呈色反应即可初步识别可能带有重组质粒的菌落。通过小量制备质粒DNA进行限制酶切分析，即可确定这些质粒的结构。

三、 材料准备

1 LB 培养基(20g/l) 250ml

2 平板培养基 500ml

Agar 15g/l

LB 20g/l

Amp 50ug/ml

3 培养皿: 12个

4 冰

5 42℃水浴

四 实验步骤

一.连接T载体

T载体连接

PCR产物 1ul(根据PCR产物的量可适当增减，最多不超过4UL)

pEASY-T1 1ul

轻轻混合，室温(22℃-37℃)反应5min，反应结束后，将离心管置于冰上。

P.S. 对于长片段(大于1kb)，室温反应10-15min。

二.转化

转化过程：

1) 取感受态细胞,放在冰上融化2-5min

2) 融化后轻弹管1-2次,重悬细胞

3) 加入连接好的质粒载体,摇动混合

4) 冰融30min

5) 42℃水浴90sec,不可摇动

6) 冰上放2min

7) 加入500ul LB培养基(不加任何抗生素，冰上加),37℃,250rpm,1-2hours

8) 取适当体积涂板,过夜培养

三.配制下次试验所需试剂：以下试剂每种配制100ml

1、solutionI：(1L)

50mM Glucose 9g

25mM Tris.Cl pH8.0 取1M Tris.Cl 25ml

10mM EDTA pH8.0 取0.5M EDTA 20 ml

灭菌15min，4°C 保存

2、solution II：(1ml)

10M NaOH 20μl

10% SDS 100μl

ddH2O 定容至1ml

37°C 溶解至清后使用

3、solutionIII：(100ml)

5MKAc 60ml

冰乙酸 11.5ml

ddH2O 28.5ml

10%SDS：(500ml)

SDS 50g

加ddH2O 400ml

68°C 溶解后定容500ml

5MKAc：(100ml)

KAc 49.07g

68°C 溶解后定容至100ml

0.5M EDTA pH8.0：(100ml)

EDTA.Na2 18.61g

加80mlddH2O溶解

NaOH 调pH8.0，定容至100ml，高压灭菌

1M Tris.Cl：(100ml)

Tris 12.1g

ddH2O 80ml溶解

HCl 调pH，用量约为： pH8.0: 4.2ml。定容至100ml，高压灭菌。

实验五 碱裂解法少量提取质粒DNA

一 实验目的

通过本实验，掌握碱裂解法提取质粒的原理方法和相关基本技术。

二 实验原理

碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，其基本原理为：

当菌体在NaOH和SDS溶液中裂解时，蛋白质与DNA发生变性，当加入中和液后，质粒DNA分子能够迅速复性，呈溶解状态，离心时留在上清中;蛋白质与染色体DNA不变性而呈絮状，离心时可沉淀下来。

碱裂解法从大肠杆菌制备质粒是分子生物学研究的常规技术，碱法质粒抽提用到三种溶液：

溶液I： 50 mM葡萄糖 、 25 mM Tris-Cl 、 10 mM EDTA，pH 8.0;

溶液II： 0.2 N NaOH、1% SDS;

溶液III ：3 M 醋酸钾 、 2 M 醋酸。

1、溶液I的作用 对于任何生物化学反应，首先要控制好溶液的pH，因此选用适当浓度和适当pH值的Tris-Cl溶液。加入的葡萄糖可以使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，可以抑制 DNase的活性和微生物生长。此步骤菌体一定要悬浮均匀，不能有结块，否则会降低抽提得率。

2、溶液II的作用 NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱后几乎在瞬间就会溶解，这是由于细胞膜发生了从bilayer(双层膜)结构向micelle(微囊)结构的相变化所导致。SDS也呈碱性，但如果只用SDS，达不到彻底溶解细胞的作用，加入SDS主要为下一步做铺垫。这一步操作要注意两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂;第二，必须温柔混合，不然基因组DNA也会断裂。

3、溶液III的作用 SDS在高盐浓度下发生沉淀，同时SDS能与蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个SDS分子，所以沉淀也将溶液中的大部分蛋白质沉淀下来。溶液中的K+置换了SDS中的Na+而形成了不溶性的PDS，高浓度的盐使沉淀更完全。同时，由于基因组DNA很长，容易被PDS共沉淀。2 M的醋酸可以中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。基因组DNA一旦发生断裂，小于100 kb的片断，就不容易与 PDS共沉淀。所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，否则最后得到的质粒上会有大量的基因组DNA污染。这一步操作混合均匀后在冰上放置，可以使PDS沉淀更充分。

4、酚/氯仿/异戊醇的作用 PDS的沉淀并不能将所有的蛋白质沉淀，酚可以使蛋白质变性，作用大于氯仿，但水饱和酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收。加入氯仿后可以增加其比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。还有，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应(比如限制性酶切反应)，因此如果单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除。而用酚/氯仿混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能正常进行。异戊醇的添加，主要可以使离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。

三. 试剂准备

1 Solution I：(100ml)

50mM 葡萄糖

25mM Tris-HCl(PH8.0)

10mM EDTA

10mg/100ml RNaseA

2 Solution II：(100ml)

0.2N NaOH

1% SDS

3 Solution III:(100ml)

3M KAc (PH5.5)

2M HAc

4酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)

5 70%乙醇 100ml

6 LB/amp 培养基 200ml(前一次实验已准备)

四.实验步骤

1 接种(实验前一晚进行)

挑取单克隆，接种到LB(Ampr或Kan)液体培养基中，37°C，220r/min，O/N;

2 质粒提取

1) 吸取1ml 菌液于Eppendorf 管中，8000 r/min 离心3min，弃尽上清。加入150μl冰预冷的solutionI，涡旋振荡30s 后置于冰上3min;

2) 加入300μl solution II，快速上下颠倒试管4-5 次，置于冰上3-5 min;

3) 再加入225μl 冰预冷的solutionIII，上下小心颠倒5-6 次，置于冰上3-5 min;

4) 12000 r/min 离心5 min。取上清(约600μl)，加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)，混匀;

5) 12000 r/min 离心5 min。取上清(约500μl)，加入2 倍体积冰预冷的无水乙醇，-20°C 静置2h 或O/N;

6) 12000 r/min 离心5min，去上清，沉淀用400μl 冰预冷70%乙醇洗2-3 次，吹干沉淀;

7) 加入15μl 含0.5U RNAase 的ddH2O 溶解沉淀，37°C 静置30min，-20°C 保存。

3 电泳检测质粒提取结果

琼脂糖电泳进行鉴定质粒DNA时，多数情况下你能看到三条带，但不要认为你看到的是超螺旋、线性和开环这三条带。碱法抽提得到质粒样品中不含线性DNA，用EcoRI来线性化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性质粒DNA的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序，分别是超螺旋、开环和复制中间体(即没有复制完全的两个质粒连在了一起)。如果你不小心在溶液II加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带，是20-100kb的大肠杆菌基因组DNA的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会有7-10条带，这是由于特殊的DNA序列导致了不同程度的超螺旋(超螺旋的圈数不同)所致。

实验六 重组载体的验证

一 实验目的

对重组T载体进行快速PCR验证及酶切验证， 以确定外源片段的正确插入。

二 实验原理及意义

许多高温DNA聚合酶，如TaqDNA聚合酶、TthDNA聚合酶等扩增的PCR产物在3`末端后都带有一个突出的碱基A，这样的PCR产物可以用3`末端后带有一个突出碱基T的载体(T克隆载体)方便地进行克隆。当把PCR扩增产物连接进入T克隆载体并转化大肠杆菌后，尽管有抗性选择(如Amp筛选)压力及蓝白斑筛选，仍需要对阳性菌株中所带有的质粒进一步验证，排除假阳性等实验误差以确保外源片断的正确插入。准确性最高的验证方法是对重组T载体进行序列测定，在测序反应之前一般可以进行快速PCR验证及酶切验证。

PCR验证即指以菌落或从菌落中提取的质粒为模板，用与插入片断特异结合的引物进行PCR扩增，如果PCR扩增能够得到的片断并且大小与预期相符则该菌株或质粒就有可能为阳性结果。由于PCR反应受多种条件的影响，特别是有可能会出现假阳性，因此，在PCR验证的基础之上还需要进行酶切验证。在酶切验证中选择合适的内切酶是关键，选择内切酶时除了要参考质粒载体多克隆位点所带有的内切酶外还要考虑到插入片断中是否带有该酶的酶切位点。

三 试剂

LB平板、长有转化菌株的平板、无菌牙签、PCR反应试剂、提取好的质粒、限制性酶切酶、电泳设备及其它

四 实验步骤

酶切验证

1. 在灭菌的1.5ml离心管依次加入下列溶液：

10×Reaction buffer 2μl

重组质粒 6μl

限制性酶切酶 各1μl

加无菌水至总体积20μl

2. 混匀，37℃水浴过夜;

3. 电泳检测反应结果。

PCR验证：

取0.5—1μl质粒作为模板进行PCR反应;电泳检测反应结果。

实验七 外源基因在原核中的表达

一 实验目的

用IPTG(异丙基硫代-β-D半乳糖苷)诱导外源基因在重组大肠杆菌菌株中表达。

二 实验原理及意义

将外源基因片段插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。大肠杆菌表达系统具有操作简单、成本低廉等特点，能够大量的获得目的蛋白，因此是一种广泛使用的基因工程体系。

原核表达系统中，合适的表达载体尤其重要，典型的应该包括有可供选择标志的编码序列、可控转录的启动子、转录终止子，多克隆位点和可在宿主体内自主复制的序列等元件。本实验中所使用的重组菌株被转化有pET30a重组质粒，即利用pET30a表达质粒将外源基因在大肠杆菌中进行表达。pET30a表达质粒带有Lac启动子，外源基因插入在Lac启动子的下游。当培养基中加入IPTG后，它们能够同阻遏物结合，使之从操纵单元部位移去，于是乳糖操纵子的抑制状态便被消除，外源基因得到表达。(参见《基因工程原理》第八章)

三 试剂

LB液体培养基、1MIPTG(抽滤灭菌)、无菌牙签、无菌试管及三角瓶、10%SDS、β-巯基乙醇

四 实验步骤

1. 分别挑取5个单菌落至5mlLB/AMP液体培养基中37℃200rpm过夜培养;

2. 以1：100的比例将过夜培养物加至新的5ml LB/AMP液体培养基中;

3. 37℃200rpm培养至OD600 为0.4–1(约3h);

4. 加入IPTG至终浓度1mM，继续培养5h;

5. 各取1ml菌液，6000rpm离心2min，去上清液，0.5ml无菌水悬浮细胞，-20℃保存

实验八 SDS-PAGE的检测

一 实验目的

用SDS-PAGE的方法检测外源基因的诱导表达情况。

二 实验原理及意义

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移取决于它所带电荷以及分子大小和形状等因素。1967年Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠(SDS),大多数蛋白质能与SDS按一定比例结合，即每克蛋白质结合1.4g的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而消除了蛋白质原有的电荷差别，使蛋白质分子电泳的迁移率主要取决于本身的分子量，而与蛋白质所带的电荷无关，在一定条件下，蛋白质的分子量的对数与电泳迁移率间呈负相关。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)使用含有一种去污剂——十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)和还原剂(通常为巯基乙醇)的样品处理液对蛋白质样品进行处理(一般煮沸3～5分钟)，通过加热和SDS可以使蛋白质变性，多亚基的蛋白质也将解离为单亚基。同时还原剂可以切断蛋白质中的任何一个二硫键(使二硫键还原)。经过这样处理的样品中的肽链都是处于无二硫键连接的，分离的状态。由于SDS是带有负电荷的分子，同时它有一个长的疏水尾巴，SDS通过疏水尾巴与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合，结合SDS的比率大约是一个蛋白质分子中每两个氨基酸残基结合一分子的SDS，大的蛋白质按比率可以结合更多的SDS。所有结合SDS的蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒，它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的大小成比例。电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而主要取决于蛋白质分子量。所以SDS-PAGE常用来分析蛋白质的纯度和大致测定蛋白质的分子量。SDS-PAGE中，去污剂既要加到凝胶介质中，也要加到电极液中，以便维持处理过的蛋白质样品的变性状态。

在蛋白质样品加到凝胶上后，接通电源，所有SDS-蛋白质复合物都向着阳极迁移。由于它们通过凝胶的速率与它们分子量的对数成反比，大的蛋白质会遇到更多的阻力，因此它们迁移的速度比小的蛋白质慢，这实际上是一种分子筛效应。但这种分子筛效应不同于凝胶过滤层析中的分子筛效应。在凝胶过滤层析中，大分子被排出在凝胶的孔径之外，因此移动很快;而在SDS-PAGE中，所有的分子都应穿过凝胶，很显然大分子的迁移是最慢的。由此就造成了各种蛋白质的迁移率的不同，结果反应在电泳后的凝胶上。凝胶通过染色(常用的考马斯亮蓝染料)出现不同的蛋白带。未知蛋白质的分子量(严格讲应是多肽链的分子量)可以通过与同一块凝胶上参考蛋白的迁移率相比较计算出来。在SDS-PAGE中，在一定的凝胶浓度下，蛋白质(实际上是多肽链)的分子量对数与多肽链的迁移率成线性关系，所以通过依据标准蛋白迁移率画出的标准蛋白分子量对数对它们迁移率的标准曲线，根据未知蛋白迁移率就可从标准曲线上求出未知蛋白的分子量。应用这一技术，只需将诱导表达后的细菌总蛋白与对照进行对比即可快速、高效地检测外源基因在原核表达系统中的表达情况。

本实验中，我们基本采用Lammli的不连续垂直平板电泳，此系统分辨率高，便于电泳样品间的相互比较，是目前科研工作中广泛采用的一个系统。不连续电泳在电泳时，使用两种浓度的凝胶。上面的称作上胶或成层胶、浓缩胶;下面的称作下胶或分离胶，同时根据电化学的弱电介质调节函数理论采用不连续缓冲体系。在浓缩胶中，由于蛋白质分子的迁移率比Cl-1低，并Gly高，泳动过程中蛋白质分子夹在引导离子Cl-1和随后离子Gly之间，并逐渐浓缩为一薄层，进入分离胶后，pH值升高，Gly有效迁移率增加而越过蛋白质分子，蛋白质分子便在随后均一的缓冲系统下分离。

三 试剂

A液(100ml)：29.2%丙烯酰胺，0.8%甲叉双丙烯酰胺

(丙烯酰胺具有神经毒性，在配制使用A液时应避免皮肤接触)

B液(100ml)：1.5M Tris-HCl (pH8.8), 0.4%SDS

C液(100ml)：0.5M Tris-HCl (pH6.8), 0.4%SDS

D液(10ml)：10%过硫酸铵

E液(200ml)(5×电极缓冲液)：900ml水中加入94g甘氨酸，15.1gTris，然后加入50ml的10%SDS ，去离子水补至1000ml

TEMED (四甲基二乙胺)

染色液：(100ml) 0.25%考马斯亮蓝，50%甲醇，10%冰醋酸

脱色液：(500ml)10%冰醋酸，30%甲醇

样品裂解液(20ml)0.5M Tris-HCl (pH6.8) 5ml

10%SDS 8ml

巯基乙醇 2ml

甘油 4ml

0.25%溴酚蓝 1ml

四 实验步骤

本实验使用凝胶：分离胶浓度12%，浓缩胶浓度4%;

1. 清洗制胶玻璃板，干燥后将两块玻璃板在电泳槽上装好，插入电泳梳子，在距离梳子下端约1cm处做一标记，取出梳子;

2. 烧杯中配制12ml的12%分离胶：4.8ml A液，3.0 ml B液，4.12ml水，67.5μl D液，12μlTEMED;

3. 混匀后灌入胶板至标记处，取适量水封口;

4. 待分离胶凝固后，去除胶上面的水分，用滤纸吸干，注意不要碰到胶面;

5. 配制6ml浓缩胶：0.81ml A液，1.5 ml C液，3.65 ml水，31μl D液，9μlTEMED;

6. 灌入浓缩胶，插入梳子;

7. 待浓缩胶凝固后，安装胶板，倒入电泳缓冲液;

8. 将处理好的样品取10-30μl加入到样品孔中，接通电源，先在10mA稳流条件下电泳直至所有样品进入分离胶，然后调整电流至20mA继续电泳;

9. 待样品前沿距胶底1cm左右时停止电泳，剥离凝胶，放入培养皿中;

10. 加入适量染色液，振荡染色2-3h;

11. 吸去染色液，加入脱色液振荡脱色，多次更换脱色液至条带清晰;

12. 吸去脱色液，加入水终止反应。