实时定量PCR（Real-time quantitative PCR）

实时定量PCR（Real-time quantitative PCR)

Vs普通PCR，RT-PCR的优势
采用封闭的检测模式，因此扩增产物导致污染的可能性比普通PCR要小得多 。
扩增产物的检测在PCR扩增过程中同时进行，并且数据的采集、分析全部由仪器自动完成，因此整个检测所需的时间比普通PCR要节省许多。
检测模式功能强大，具备定性、定量、突变、多项目等检测功能。而普通PCR要完成上述项目需采用不同的技术平台。
进行定量检测时，其定量线性范围（5-6 logs）比普通PCR（2-3 logs）要宽得多。
Real-time定量PCR仪是在普通PCR 仪的基础上再配备一个激发光源和荧光信号检测系统的装置。通过PCR反应的数学函数关系，加入标准品，可以对待测样品中的目标基因进行准确定量。

Real-Time PCR

热循环仪（PCR仪）

荧光检测系统

计算机及软件系统

回顾： PCR基本原理
PCR是在试管中进行DNA复制反应，基本原理与体内相似
在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶等存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。
基本步骤
变性：加热使双链DNA变为单链
退火：降温使引物和互补模板在局部形成杂交链
延伸：耐热DNA聚合酶按5′→3′方向催化以引物为起始点的延伸反应

示意图

Real-time定量PCR仪是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

在real-time Q-PCR中，对整个PCR反应扩增过程进行了实时的监测和连续地分析扩增相关的荧光信号，随着反应时间的进行，监测到的荧光信号的变化可以绘制成一条曲线。在PCR反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，为了便于对所检测样本进行比较，在real-time Q-PCR反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值(threshold)是以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。

Linear ~20 to ~1500

Linear ~20 to ~1500 检测PCR产物 的量是在PCR反应处于指数期的某一点上，并且由此来推断模板最初的含量。

样本的域值循环数（Ct）的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。

域值循环数（Ct）的含义：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值 （threshold） 时所经历的循环数。

研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，因此只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。

目前real-time Q-PCR所使用的荧光化学方法主要有五种，分别是：DNA结合染色，水解探针，分子信标，荧光标记引物，杂交探针。它们又可分为扩增序列特异和非特异的检测两大类。

扩增序列非特异性检测方法
DNA双链非特异性内嵌染料（SYBR GreenⅠ）能特异性地结合到双链DNA上，而不结合到单链DNA上，并且结合后的染料的发光强度会明显增加，没有结合的染料在溶液中只能发出很微弱的荧光。

扩增序列特异性检测方法
扩增序列特异性检测方法是在PCR反应中利用标记荧光染料的基因特异寡核苷酸探针来检测产物，它又可分为直接法和间接法。
间接的方法就是利用水解探针的策略（TaqMan系统）。

间接法：TaqMan系统
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5′端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3′端荧光淬灭基团（发生荧光共振能量转移，FRET），因此探针完整时，检测不到该探针5′端荧光基团发出的荧光。

TaqMan探针工作原理示意图

直接法；分子信标
本质上是一种标记荧光的发夹探针，当探针分子呈发夹结构时，结合在其两端的荧光基团距离上接近，使得产生能量转移效应，而不发生荧光。当互补序列出现时，探针与DNA杂交，探针转变成一个开放的结构，呈线性，报告荧光基团与淬灭荧光基团彼此在空间上产生足够的分离，荧光基团脱离了淬灭基团的影响，从而产生可被检测到的荧光 。
分子信标作用机理简图

定量方法
相对定量和绝对定量
相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。
标准曲线法的相对定量
比较Ct法的相对定量
标准曲线法的绝对定量

在标准曲线定量中，标准品的制备是一个必不可少的过程。
理想的标准品
在所有细胞中表达相同的拷贝数
所有细胞均有表达
中等拷贝数优势
目前无一统一标准