面积归一法得出的结果可靠吗？

        色谱做多了，经常被问道这样的问题：“我这个合成品，怎么含量只有80%，核磁图上看很干净呀？怎么回事？”在CRO这行，具体情况是这样的：由于合成的都是新化合物，少有标品，一般都是用面积归一法给出含量结果。

        事实上，不考虑其它分析结果，单从面积归一化法考虑，是无法判断样品确切的含量的。如果合成的相关化合物结构比较类似，都有紫外吸收，其紫外吸收曲线比较一致，有一定的参考价值。但一般情况下，其可靠性是很差的。为了得到可靠的结果，可以在不同波长下看看其面积归一化法的结果，或许可以发现在230nm下占80%，在270nm占30%，相信那一个，那要比较不同化合物紫外吸收的最大波长及其摩尔吸收系数了。如果存在大量无紫外吸收的物质，则紫外面积归一化的结果更不可信，有条件的用其它检测器分析比较一下。另外，用紫外测定低紫外吸收的物质，当混了强紫外吸收的杂质时，可能会出现实际含量98%，而测得的结果只有10%。所以在用紫外检测器得到面积归一化的含量结果时，要充分了解样品的特性，尤其是紫外吸收波长，结合实际情况，才能作出合理的判断。

        既然面积归一法定量这么不可靠，那我们为什么还要用呢？因为作为一种测试手段，面积归一法还是能给出很多参考信息的：比如能看到你这里边最少有几个杂质；而对于纯的物质的判定，往往并不通过外标法或内标法测定（因仪器定量方法的误差在1－2%），而是采用面积归一化法结合其它测定结果。具体如下：

1 样品采用其它手段，确认主体是你所需的化学结构，例如采用NMR的氢谱和碳谱及其相关的二维谱，从谱图上基本看不到其它杂质峰。有时，色谱因条件关系，无法分离，核磁可以提供一些判断。

2 在基本断定样品很纯条件下，用顶空色谱法测定残留溶剂，要求总量不大于0.1%。因为这些溶剂无法用液相测定。

3 测定样品中游离的水分，一般要求小于0.2%（本身含结晶水的样品例外），在液相色谱中无法测定其含水量。

4 测定样品中灼烧残渣或灰分，一般要求小于0.1%（本身含金属或无机盐例外），在液相中无法测定无机盐类。

5 用离子色谱测定可能存在的一些小分子有机酸，如微量的甲酸不能用液相和气相检测。

6 其它辅助手段，如熔点、折光率、元素分析等同文献相一致。

7 在以上结果的基础上，面积归一法分析的可靠性就有了依托。一般一个样品的分离完全的判断，至少用2个不同的方法，最好用合成的前体、相关副产物或相关原料在相同条件下进行色谱分离，确保色谱峰不重叠。另外，紫外检测器是选择性检测器，不同物质在不同波长下其紫外摩尔吸收系数相差很大，习惯上我们在其最大波长下测定，但一般这样测得的值偏高，有些紫外吸收小的或不吸收的物质难以检测。而在低波长测定时，应注意溶剂峰对测定的干扰。样品的色谱进样量应在合理的范围内，如果太高，接近仪器的响应值极限，则含量偏低，杂质变多。如果样品有手性异构体，判断手性组分的含量，则用特殊的手性柱来分离。