多肽常识
大多肽在-20℃很稳定，特别是冷冻干燥并保存在干燥器中，在将它们暴露于空气之前，冷冻干燥多肽可以放于室温。这将是湿度影响减少，当无法冷冻干燥时，最好的方法是以小的工作样量存放。
对于含Cys, Met orTrP的多肽，脱氧缓冲剂对其溶解必不可少，因为这种多肽可易空气氧化，在封瓶前，慢慢流过多肽的氮气或氩气也会降低氧化作用。含Gln或Asn的多肽也容易降解，所有这些肽与不含这些有问题解苷的那些肽相比，生命期有限。
溶解性：
大多肽的道选溶剂是超纯抽气水。稀乙酸或氨水分别对于碱性或酸性多肽的溶解很重要。这些方法不溶的多肽，需要DMF、脲、guanidiniam chloride或acetonitnle来溶解，这些溶剂可能某些实验有副作用。所以我们建议设计多肽时要加注意。
残基Ala, Cys , Ile, Leu, Met, Phe和Val将全增加多肽的溶解难度。
多肽的保存和操做
包装 1mg或更少的多肽按净重包装，声明的小瓶重不含相关抗离子和水。例如，氨基酸分析决定的肽含量是80%，在1mg样品中，那么瓶中毛重是1.25mg。
大量的多肽以毛重算。标出的重量含相关抗离子和水，例如，25mg样品中肽百分比为90%，那么，实际肽量为25mg×90%=22.5mg
不要把肽含量和纯度搞混了。肽的纯度可能是100%，而肽含量相关带电基团（如Arg, Lys ）的抗离子量和肽新水性决定。这是合成肽的本身特性。
冻干肽的保存
所有产品应存于冰箱，最好为-20℃。多数肽以此方法可以存放几年不变。
肽溶液的保存
溶液肽远比冻干形式不稳定，溶液应为中性pH(pH5-7), -20℃保存的，为避免样品的反复冻融，最好分成小样存放。一份样品融冻后未用完，应扔掉，细菌降解有时会成为溶液肽的麻烦， 为克服此，肽应溶于无菌水，或肽溶液用0.2μ M滤膜过滤。
多肽的重建和操作
多数肽溶于无菌蒸溜水。初次溶解时，要注意使初始浓度比要求浓度大，如果多肽仅有限溶解性，这便允许加入其它溶解剂或缓冲盐。
如果多肽在水中的溶解性有限，有几种选择可帮助溶解：
对碱性肽用稀乙酸（含Arg , Lys , His）
酸性肽用稀氨水（含Asp, Glu）
对极疏水的肽用10%有机修饰物（Acetonitnile , Methanol）
极不溶的肽用DM50或DMF
guanicline hydrochloride或脲的浓溶液也很有用， 与上述方法合用，声处理也是溶解多肽的有效手段。
多肽的包装
目录中所有多肽除特别说明外，纯度为95~98%。包装为小瓶冻干粉。除特别注明外，多肽净重包装， 例如，1mg瓶的β-amyloid 1-40精确含1mg的多肽。多肽净重由氨基酸分析得到的肽含量计算。例如，一个多肽样品毛重5mg，氨基酸含量85%，多肽净重为5mg×0.85=4.25mg。请注意，多肽含量不是多肽纯度，与抗离子象乙酸盐和溶剂，特别是水结合量合成多肽的本身特性。多肽纯度可能达100%，但合成品中多肽含量由氨基酸组成，硫水性，和多肽对溶剂和离子的暴露决定，特别是在纯化过程中，无论多肽如何纯，冻干粉多肽含量一般为70-85%。剩余15-30%由其它基本非肽成份构成。
多肽应用和保存
多肽具广泛的溶解性。多肽不溶的主要问题是形成二级结构。除了最太肽外，这点都会发生，在有多重疏水残基的肽中更显著。盐会促进二级结构形成。我们建议先在无菌蒸馏水或去离子中溶解多肽。如需要增加溶解率，可用声处理。溶解仍有问题，加少量稀乙酸（10%）或氨水，会便于溶解。
要长期保存多肽，最好冷冻干燥，冷干粉可在-20℃或更低存放几年而很少或无降解。溶液中的多肽远不稳定。多肽易受细菌降解，应用无菌纯化水溶解。
含有Met, Cgs或Try残基的多肽溶液由于氧化，寿命有限。应溶于无氧溶剂，为防止重复冻融的破坏，建议溶解过量的肽的便实验，其余多肽以固体形成保存。
固相多肽合成Fmoc方法
任何多肽链的关键连接为肽键，由一个氨基酸的氨基与另氨基酸的缩合形成。通常一个氨基酸由一个中心碳原子组成，它由四个基它基团包围：氨基、羰基、基和侧链。侧链，称为R，区别不同氨基酸的结构。某些侧链含有干扰肽键形成的功能团。因此侧链功能团的封闭很重要。
图工显示了Fmoc合成的一般流程，首先第一个Fmoc氨基酸通过一个酸性接头接到不溶载体树脂上，Fmoc去保护通过用碱处理树脂来完成，一般是Poperidine。用预先激活或原位激活连接第二个Fmoc氨基酸。要求总多肽合成后，通过TFA分离来除去树脂和去保护。
Fmoc分离
固相多肽合成中多肽分离主要用酸解
Fmoc法用弱酸，比如TFA或TMSBr。各种添加剂， 一般为thiol compound , 水和酚，用来保护多肽的免分离中Carbocation的破坏。
下列保护基与TFA和TMSBr分离相合：（略）
基于保护基团的类别，必须使用去保护剂的组合。 例如，当Boc和tButyl存在时，它们的Carbocation对应物能与Trp, Tyr和Met反应形成tbutyl产物。EDT是极有效的t-butyl trifluoroacetate清除剂， 但它不保护Trp。因此，必须加水以控制烷基化。Trp的吲哚环和Tyr的OH极易与Pmc反应。水再次表现出对此反应的抑制。Trt和Mtr基团也有相似情形。较此适当组合清除剂将极大降低副反应。
tBoc和CBZ多肽合成
tBoc合成法见图3
tBoc法的分离法
Boc使用强酸，比如HF，TFMSA或TFMoTf。分离加入各种添加剂，一般为thiol化合物以保护多肽免受carbocation破坏。
HF分离法（如下）略
TFMSOTf分离
TMSOTf分离
SPPS的一般连接方法
适于固相多肽合成的连接反应要求酰化反应，对同源多肽最有效。
Fmoc SPPS连接方法 FmocSPPS最常用的连接法是活性酯，要么原位，要预先激活。起初P-nitrophenyl和N-hydnxysuccinimide激活酰是常用形式。甚至，有HOBt时，连接反应也很慢，此外，Fmoc氨基酸ONSu、酯与succinimido-carbonyl-β-alanine -N-Hydroxysuccinidide酯副产物的形成相关。今天最常用的激活酯是Opfp和Odhbt。有HoBt时反应速度极快，副产物少。
另一方面， 使用象DCC，HBTU，BOP，BOP-Ce，或TBTU活化剂时，能原位进行许多连接反应。Carbondiimide的直接添加是最佳选择。然而，TBTU和HBTU第二个出现，接着BoP, 最后是BoP-CE。再者，酯连接发现BoP/HoBt>Carbodiimido/HoBt> Carbodiimido/ODHbT> Carbodiimide/Opfp。
最近以来，HOAt和其对应Uronium盐同类物HATU的发展，发现此HoBt和HBTU具更强催化活性，结果是增加连接产出，缩短连接时间， 消旋降低。故此，更适合阻位氨基酸的连接，使得难合成肽的合成更成功。
tBoc SPPS的普通连接法
Carbodiimides, 主要是DCC是使用多年的连接试剂，主要的问题是激活和酰化过程中dicyclohexylurea的沉淀。并且伴有许多副反应，已有几种产生可溶脲的Carbodiimide，例如DIC, t-butylmethyl-和t-tatyllethyl-carbodiimide, 但是这些试剂未解决副反应的问题。结果生产出了新的激活剂。首先是ＢＯＰ，随后是PyBrop, PyBOP, HBTU, TBTU和ＨＡＴＵ。所有前述试剂都要活性碱基。
所有前面讨论的ＤＣＣ及其衍生物都通过对称酐的形成起作。通常，对称酐反应性极强已广泛用于ＳＰＳＳ，特别t-Boc合成中，对称酐整合入Fmoc氨基酸有一些困难，例如，从N-(3-dimethylamino propyl ) -N?/FONT>-ethyl -carbodiimides -HG制备的对称酐，由于Z-alkory-5(4H)-oxayolne中间体的形成， 在Carbodiimidie和tertiany amines存在时重排， 还有， 不是所有的Fmoc 对称酐都溶于ＤＣＭ，或者无论所有试剂如何都不溶。
对称酐的另一种改变是混合酐，Carboxglic-Carbonate或Ｃarboxglic-phosphinic混合酐，典型的情况且是， 由活性isobutyl-或isopropyl-choroformate制备这些，用Nox被阻氨基酸代替phosphinic chloride。通常反应迅速及少或无有副反应。
混合酐，N-carboxy酐(NCAS), 也叫，Leuch酐，已广泛用于多聚氨基酸制备，这类化合物联合Nox保护和活化炭基，一旦和另一个氨基酸或肽残基反应，释放CO2做为副产物。
用光气处理α氨基酸很容易得到ＮＣＡ衍生物，在严格调控条件下，ＮＣＡ衍生物常结晶析出，便可使用。这些条件要求严格控制合成中的ＰＨ，在ＰＨ值低于１０时，ＮＣＡ和肽或氨基酸残基反应产物，肽-Carbamate易失去CO2形成自由α－氨基端，发生聚合。pH10.5时，ＮＣＡ便水解隆解。所以反应在ＰＨ10.2条件下进行。别的条件要求是反应在０℃进行2分钟，要强烈搅动。反应产物老消旋， 带有自由α-氨基，可以增加另一个酐而延伸。
液相合成
基于将单个N-α保护氨基酸反复加到生长的氨基成份上，合成一步步地进行，通常从合成链的C端氨基酸开始，接着的单个氨基酸的连接通过用DCC，混合炭酐，或N-carboxy酐方法实现。Carbodiimide方法包括用DCC做连接剂连接N-和C-保护氨基酸。重要的是，这种连接试剂促接N保护氨基酸自己炭基和C保护氨基酸自由氨基间的缩水，形成肽链，同时产出N，N?/FONT>-dyaylcohercylurea副产物。 然而，此方法因其导致消旋的副反应，或在强碱存在时形成5(4H)-oxaylones和N-acylurea而受到影响。庆幸地是，这些副反应能最小化，如果还不能完全消除。方法是加入象HoSu或HoBT这样的连接催化剂，此外，此方法也可用于合成N保护氨基酸的活性酯衍生物。依次产生的活性酯将自发与任何别的C保护氨基酸或肽反应形成新的肽。
当从副产品, diaydohexylurea分离活性酯有困难时，可用混合Carbonic酐方法，此方法由两步组成，第一步是在有tertiary碱的有机溶剂中用适当的酰基氯激活Nx保护氨基酸的炭基，第二步是让肽或氨基酸的自由氨基与Carbonic酐反应。Carbonic酐通常加到自由氨基的14倍。
虽然此方法在低温时高效高产，产品纯， 但也有其缺点，例如，由羰基的强激活酐衍生物有消旋倾向。然而此问题在使用Nx-α-Urethane保护基（Cb2, 或tBoc）时便不会发生。进一步： 由于高反应性， 混合Carbonic酐倾向5(4H)-oxagolomes, Urerbanes diacyimide, 酯的形成，并易失调。
促进这些副反应的条件是高温，延长激活时间（即，混合酐形成后，加到alkylchlorocarbonate和amine成份的时间，amine组成的空间占位，平共处和混合酐的不完整形成。幸运的是，大多这些副反应，除形成哑唑酮和脲烷外，可通过低温进行反应（~-15℃），大为减少，并且缩短活化时间（~1-2分钟）。为了使哑唑酮和尿烷形成最少，要实行如下措施：1）必要性须用无水有机溶剂，乙酸，四氢喃，t-butand, 或acetonitrile; 2）应使用tertiary碱和N-methglmorpholine；3） 必须用C b2或tBoc N- α保护氨基酸。
虽然用isobutyl-和ethylchlorocarbonate常用来形成羰酐，但确有别的连接试剂，例如，EEQD和IIQD用来与CarboxaP成份反应形成erhyl-或isobutyl carbonate衍生物。不同于传统酐程序，EEQD和IIQD不要求碱，也不要求低温，通常要求一种有机溶剂（有许多也用）中0.1-0.4M浓度的等摩尔量的羰和氨成份。之后EEQD或IIQD多加5-10%, 温合液室温搅拌15-24小时。真空除去溶剂后，残留物溶于乙酸，用1NHaHCO3 , 10% 枸橡酸和盐水洗剂，之后用无水Na2So4干燥，蒸发，产品可以重晶结或层析纯化。
这种方法避免了用碱，但仍有消旋和尿烷副产物，水平与经典相当。所以优势中于容易方便，但应注意，两种方法的详细比较，目前为重仍未有。
HPLC分析和纯化
分析HPLC使用柱子和泵系统，可以经受传递高压，这样可以用极细的微粒（3-10μ m）做填料。由此多肽要在几分钟内高度被分析。
HPLC分两类：离子交换和反相。离子交换HPLC依靠多肽和固相间的直接电荷相互作用。柱子在一定PH范围带有特定电荷衍变成一种离子体，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸组成表现出相反电荷。分离是一种电荷相互作用，通过可变PH， 离子强度，或两者洗脱出多肽，通常，先用低离子强度的溶液，以后逐渐加强或一步一步加强，直到多肽火柱中洗脱出。离子交换分离的一个例子使用强阳离子交换柱。如sulfoethylaspartimide通过酸性PH中带正电来分离。
反相HPLC条件与正常层析正相反。多肽通过疏水作用连到柱上，用降低离子强度洗脱，如增加洗脱剂的疏水性。通常柱子由共价吸附到硅上的碳氢烷链构成，这种链长度为G4-G8碳原子。由于洗脱是一种疏水作用。长链柱比短链对小的，高带电肽好。另一方面大的疏水肽用短链柱洗脱好。 然而，总体实践中，这两类柱互变无多少显著差别，别类载体由碳水化合物构成，比如苯基。
典型的操作常由两绶冲剂组成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA--H2o稀acetonitrile。用线型梯变以每分钟0.5%到1.0%改变的速度混合。常见分析和纯化用柱为4.6×250mm(3-10μ m)和22×250mm(10μ m). 如果用径向填柱，那么大小是8×100（3-10μ m）和25×250mm(10μ m)
大量各种缓冲剂含许多不同试剂，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸，稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸钠/氨，TFA/TEA，磷酸钠或钾，异戊酚。这样许多不同组合可形成缓冲剂，但要注意一点：硅反相柱料不能长时间暴露于高pH，甚至微碱pH，因为这样会破坏柱子。
纯化
SPPS提取的粗肽含许多副产物，早期的纯化方法包括离子交换，分溶和反溶注析，更现代的方法是反相HPLC，一般于60残基或更少的肽很成功。当反相HPLC失败时，可按合离子交换HPLC。
通常分析HPLC结果用于决定纯化条件。例如，一种太肽用30%（0.1%TFA）acetonitrile洗脱出，这是分析HPL定出的。那么选择acctonitrile浓度更低的缓冲液使得在isocratic条件下（比如28%,0.1% TFA acetonitrile）多肽在溶剂保持时间4-5分钟后洗脱。这样，根据柱子类型， 我们的纯化条件用16-35%(0.1%TFA) acetonitrile线型梯度，在一两小时内完成，之后用分析HPLC查检各种比例，使用我们isocranic条件选定的缓冲液。
多肽物质分离与分析方法研究进展
多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用。不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。
1 分离方法
采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、叫泳等。
HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其它化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。
1．1．1 反相高效液相色谱（RP-HPLC）
结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨基酸组成对保留系数影响的关系，其中极性氨基酸残基在2～20氨基酸组成的肽中，可减少在柱上的保留时间；在10～60氨基酸组成的肽中，非极性氨基酸较多也可减少在柱上的保留时间，而含5～25个氨基酸的小肽中，非极性氨基酸增加可延长在柱上的保留时间。同时有不少文献报道了肽链长度、氨基酸组成、温度等条件对保留情况的影响，并利用计算机处理分析得到每种多肽的分离提取的最佳条件。
肽图分析（Peptide Mapping）：肽图分析是根据蛋白质、多肽的分子量大小以及氨基酸组成特点，使用专一性较强的蛋白水解酶[一般未肽链内切酶（endopeptidase）]作用于特殊的肽链位点将多肽裂解成小片断，通过一定的分离检测手段形成特征性指纹图谱，肽图分析对多肽结构研究合特性鉴别具有重要意义。利用胰蛋白酶能特意性作用于Arg和Lys羧基端的肽链的性质，通过RP-HPLC法采用C18柱检测了重组人生长激素特征性胰肽图谱。同时胰岛素的肽图经V8酶专一裂解也制得，并可鉴别仅相差一个氨基酸残疾的不同种属来源的胰岛素。人类肿瘤坏死因子的单克隆抗体结构也应用酶解法及在线分析技术确定了肽图，便于鉴定分析。此项技术已经在新药开发中得到广泛应用。
1.1.2 疏水作用色谱（Hydrophobic interaction chromatogrphy，HIC）
HIC是利用多肽中含有疏水基因，可与固定相之间产生疏水作用而达到分离分析的目的，其比RP-GPLC具有较少使多肽变性的特点。利用GIC分离生产激素（GH）产品的结构与活性比EP-GPLC分离的要稳定，活性较稳定。Geng等利用HIC柱的低变性特点，将大肠杆菌表达出的经盐酸胍乙啶变性得到人重组干扰素-γ。通过HIC柱纯化、折叠出高生物活性的产品。不同人尿表皮生长因子（EGF）也利用HIC纯化到了，均具有良好的生物活性。HIC可将未经离子交换柱的样品纯化。而RP-HPLC则不能达到这一要求。
1.1.3 分子排阻色谱（Sizs-Exclusion chromatogrphy，SEC）
SEC是利用多肽分子大小、形状差异来分离纯化多肽物质，特别对一些较大的聚集态的分子更为方便，如人重组生长激素（hgH）的分离，不同结构、构型的GH在SEC柱上分离行为完全不同，从而可分离不同构型或在氨基酸序列上有微小差异的变异体，利用SEC研究修饰化的PEG的分离方法，此PEC具有半衰期长、作用强的特点。一些分子量较大的肽或蛋白均可利用此法分离分析。
1．1．4离子交换色谱（Iron-Exchange chromatography,IEXC）
IEXC可在中性条件下，利用多肽的带电性不同分离纯化具有生物活性的多肽。其可分为阳离子柱与阴离子柱两大类，还有一些新型树脂，如大孔型树脂、均孔型树脂、离子交换纤维素、葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶树脂等。在多肽类物质的分离分析研究中，对多肽的性质、洗脱剂、洗脱条件的研究较多，不同的多肽分离条件有所不同，特别是洗脱剂的离子强度、盐浓度等对纯化影响较大。Wu等报道利用离子交换柱层析法，探讨分离牛碳酸酐异构体和牛血清白蛋白、鸡血清白蛋白酶的提取条件，获得了有价值的数据供今后此类物质分离研究。
1．1．5膜蛋白色谱（Chromatography of Membrane Protein,CMP）
CMP+分离强蔬水性蛋白、多肽混合物的层析系统，一般有去垢剂（如SDS）溶解膜蛋白后形成SDS-融膜蛋白，并由羟基磷灰石为固定相的柱子分离纯化。羟基磷灰石柱具有阴离子磷酸基团（P-端），又具有阳离子钙（C-端），与固定相结合主要决定于膜蛋白的大小、SDS结合量有关。利用原子散射法研究cAMP的分离机制发现，样品与SDS结合后在离子交换柱上存在SDS分子、带电荷氨基酸与固定相中带电离子间的交换，从而达到分级分离的目的。
1．1．6高效置换色谱（High-Performance Displacement Chromatography,HPDC）
HPDC是利用小分子高效置换剂来交换色谱柱上的样品，从而达到分离的目的。它具有分离组分含量较少成分的特性。利用HPDC鉴定分离了低于总量1%组分的活性人重组生长激素（rHG ）。在研究非毒性交换剂时Jayarama发现硫酸化葡萄糖（Detran Sulfate，DS）是对β乳球蛋白A和B的良好置换剂，一般DS的相对分子质量为1×104和4×104最宜。研究表明置换剂的相对分子质量越低，越易于与固定相结合，因此在分离相对分子质量小的多肽时，需要更小的置换剂才能将其置换纯化出来。
1.1.7 灌注层析（Perfusion Chromatography，PC）
PC是一种基于分子筛原理与高速流动的流动相的层析分离方法，固定相孔径大小及流动相速度直接影响分离效果。试验证明其在生产、制备过程中具有低投入、高产出的特性。目前市场上可供应的PC固定相种类较多，适合于不同分子量的多肽分离使用。
1.2 亲和层析（Affinity Chromatography，AC）
AC是利用连接在固定相基质上的配基与可以和其特异性产生作用的配体之间的特异亲和性而分离物质的层析方法。自1968年Cuatrecasas提出亲和层析概念以来，在寻找特异亲和作用物质上发现了许多组合，如抗原-抗体、酶-催化底物、凝集素-多糖、寡核苷酸与其互补链等等。对多肽类物质分离目前主要应用其单抗或生物模拟配基与其亲和，这些配基由天然的，也有根据其结构人工合成的。Patel等人利用一系列亲和柱分离纯化到了组织血浆纤维蛋白酶原激活剂蛋白多肽。
固定金属亲和层析（Immobilized Metal Affinity Chromatography.LMAC）是近年来发展起来的一种亲和方法。其固定相基质上鳌合了一些金属离子，如Cu2+、Ni2+、Fe3+等，此柱可通过配为键鳌合侧链含有Lys、Met、Asp、Arg、Tyr、Glu和His的多肽，特别是肽序列中含有His-X-X-X-His的结构最易结合到金属离子亲和柱上，纯化效果较好。其中胰岛素样生长因子（Insylin Like Growth Factor，IGF）、二氢叶还原酶融合蛋白等均用此方法分离到纯度较高的产品。
Chaiken等人报道了另一种亲和层析方法，利用反义DNA表达产生，其与正链DNA表达产生的肽或蛋白具有一定的亲和性，如Arg加压素受体复合物，已用此法分离得到。DNA与蛋白、多肽复合物之间的作用也是生物亲和中常用的方法。将人工合成的寡核苷酸结合在固定相基质上，将样品蛋白或多肽从柱中流过，与之结合可达到分离特定结构多肽的目的。
1.3 毛细管电泳（Capillary electrophoresis，CE）--分离分析方法
CE是在传统的电泳技术基础上于本世纪60年代末由Hjerten发明的，其利用小的毛细管代替传统的大电泳槽，使电泳效率提高了几十倍。此技术从80年代以来发展迅速，是生物化学分析工作者与生化学家分离、定性多肽与蛋白类物质的有利工具。CE根据应用原理不同可分为以下几种；毛细管区带电泳Capillary Zone electrophoresis，CZE）、毛细管等电聚焦电泳（Capillary Isoeletric Focusing，CIEF）毛细管凝胶电泳（CapillaryGelElectrophore
1.3.1 毛细管区带电泳（Capillary Zone Electrophoresis，CZE）
CZE分离多肽类物质主要是依据不同组分中的化合物所带电性决定，比传统凝胶电泳更准确。目前存在于CZE分离分析多肽物质的主要问题是天然蛋白或肽易与毛细管硅胶柱上的硅醇发生反应，影响峰形与电泳时间，针对这些问题不少学者做了大量实验进行改进，如调节电池泳液的PH值，使与硅醇反应的极性基团减少；改进毛细管柱材料的组成，针对多肽性质的不同采取不同的CZE方法研究分离5个含9个氨基酸残基的小肽，确定了小肽分析的基本条件，即在低PH条件下，缓冲液中含有一定浓度的金属离子如Zn2+等，此时分离速度快而且准确。
1．3．2细管等电聚电泳（Capillary Isleletric Focusing,CIEF）
由于不同的蛋白、多肽的等电点（PI）不同，因此在具有不同pH梯度的电泳槽中，其可在等电点pH条件下聚集沉淀下来，而与其他肽类分离开来。CIEF在分离、分析混合多肽物质中应用不多，主要应用与不同来源的多肽异构体之间的分离，如对rHG不同异构体分离。由于在CIEF柱表面覆盖物的不稳定性限制了此法的广泛应用。
1．3. 3毛细管凝胶电泳 (Capillary Gel Electrophoresis,CGE)
CGE是基于分子筛原理，经十二烷基磺酸钠（SDS）处理的蛋白或多肽在电泳过程中主要靠分子形状、分子量不同而分离。目前，又有一种非交联欢、线性、疏水多聚凝胶柱被用于多肽物质的分离分析，此电泳法适于含疏水侧链较多的肽分离，这种凝胶易于灌注，使用寿命长，性质较为稳定。
1．3．4胶束电动毛细管层析（Micellar Electrokinetic Electorphoresis Chromatography, MECC）
MECC的原理是在电泳液中加入表面活性剂，如SDS，使一些中性分子带相同电荷分子得以分离。特别对一些小分子肽，阴离子、阳离子表面活性剂的应用都可使之形成带有一定电荷的胶束，从而得到很好的分离效果。有文献报道在电解液中加入环糊精等物质，可使用权含疏水结构组分的多肽选择性与环糊精的环孔作用，从而利用疏水作用使多肽得到分离。
1．4多肽蛋白质分离工程的系统应用
以上提到的分离多肽的技术在实际应用过程中多相互结合，根据分离多肽性质的不同，采用不同的分离手段。特别是后基因组时代，对于蛋白质组深入的研究，人们对于分离多肽及蛋白质的手段不断改进，综合利用了蛋白质和多肽的各种性质，采用包括前面提到的常规蛋白多肽提取方法，同时利用了高效液相色谱，毛细管电泳，2-D电泳等手段分离得到细胞或组织中尽可能多的蛋白多肽。在蛋白质组学研究中系统应用蛋白和多肽分离鉴定的技术在此研究中即是分离手段也是分析方法之一。特别是以下提到的质谱技术的发展，大大的提高了蛋白多肽类物质的分析鉴定的效率。
2 分析方法
2．1 质谱分析（Mass Spectrometry, MS）
MS在蛋白、多肽分析中已经得到了广泛应用，特别是在分离纯化后的在线分析中，MS的高敏性、快速性特别适合多肽物质分析鉴定。其中连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）和电雾离子化质谱（Electrospray Ionization, EIS）是近几年发展起来的新方法。
2．1．1连续流快原子轰击质谱（Continuous-Flow Fast Atom Bombardment, cf-FAB）
cf-FAB是一种弱离子化技术，可将肽类或小分子量蛋白离子化成MH+或（M-H）形式。主要应用于肽类的分离检测，其具有中等分辨率，精确度大于+0.2amu，流速一般在0.5-1.5μl·Ml-1。在测定使流动相需加0.5%-10%基质如甘油和高有机溶剂成分，使样品在检测探针处达到敏感化。cf-FAB常与HPLC、CEZ等方法结合使用达分离分析的目的，许多多肽的cf-FAB分析方法已经建立，并得到很好的应用。如Hideaki等利用此法研究L-Pro、L-Ala的四肽化合物系列。证明L-Pro在保持小肽构相稳定性。连接分子方面具有重要意义。
2.1.2 电雾离子化质谱（Electrospray Ionozation，EIS）
EIS可产生多价离子化的蛋白或多肽，允许相对分子质量达1×105蛋白进行分析，分辨率在1500-2000amu。精确度在0.01%左右。EIS更适合相对分子质量大的蛋白质的在线分析，且需要气化或有机溶剂使样品敏感化。利用EIS与HPLC联合分离分析GH和血红蛋白均获成功，其也可与CEZ联合应用。
2.1.3 基质辅助激光解析/离子化-飞行时间质谱（Matrix-associated laser disso-ciation/ionization time of flight mass spectrmtry，MALDI-TOF MS）
MALDI-TOF是目前蛋白质鉴定中精确测定测定分子质量的手段，特别适合对混合蛋白多肽类物质的相对分子质量的测定，灵敏度和分辨率均较高。它是目前蛋白质组学研究的必备工具。同时结合液相色谱的联用技术可以高效率的鉴定多肽物质。特别是当各种原理的质谱技术串联应用时，不但可以得到多肽的相对分子质量信息，还可以测定它的序列结构，此项技术将在未来蛋白质组学研究中起到决定性作用。
2.2 核磁共振(Nuclear Magnetic resonance，NMR)
NMR因图谱信号的纯数字化、过度的重叠范围过宽（由于相对分子质量太大）核信号弱等原因，在蛋白、多肽物质的分析中应用一直不多。随着二维、三维以及四维NMR的应用，分子生物学、计算机处理技术的发展，使NMR逐渐成为此类物质分析的主要方法之一。NMR可用于确定氨基酸序列、定量混合物中的各组分组成含量等分析中。但要应用于蛋白质分析中仍有许多问题需要解决，例如，如何使分子量大的蛋白质有特定的形状而便于定量与定性分析，如何减少数据处理的时间问题等。这些问题多有不少学者在进行研究。虽然在蛋白质分析中应用较少，NMR在分析分子中含少于30个氨基酸的小肽时是非常有用的，可以克服上述蛋白质分析中的缺点而达到快速准确分析的目的。
2.3 其他
除上述方法之外，氨基酸组成分析、氨基酸序列分析、场解析质谱、IR、UV光谱、CD、圆而色谱、生物鉴定法、放射性同位素标记法及免疫学方法等都已应用于多肽类物质的结果鉴定、分析检测之中。
以上简要的介绍了近几年多肽物质分离、分析的常用方法及最新研究方向。随着科学技术水平的不断发展，会有许多更新的分离分析手段不断涌现，因此这一领域的研究具有广阔的前景。
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世界多肽药物的研究开发概况 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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发布人：管理员 点击次数：1106次 发布时间：2007年8月16日 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
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