扫描电子显微镜!

　　扫描电子显微镜的设计思想和工作原理，早在1935年便已被提出来了。1942年，英国首先制成一台实验室用的扫描电镜，但由于成像的分辨率很差，照相时间太长，所以实用价值不大。经过各国科学工作者的努力，尤其是随着电子工业技术水平的不断发展，到1956年开始生产商品扫描电镜。近数十年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、冶金学等学科的领域中，促进了各有关学科的发展。

　　一.扫描电镜的特点

　　和光学显微镜及透射电镜相比，扫描电镜具有以下特点：

　　(一) 能够直接观察样品表面的结构，样品的尺寸可大至120mm×80mm×50mm。

　　(二) 样品制备过程简单，不用切成薄片。

　　(三) 样品可以在样品室中作三度空间的平移和旋转，因此，可以从各种角度对样品进行观察。

　　(四) 景深大，图象富有立体感。扫描电镜的景深较光学显微镜大几百倍，比透射电镜大几十倍。

　　(五) 图象的放大范围广，分辨率也比较高。可放大十几倍到几十万倍，它基本上包括了从放大镜、光学显微镜直到透射电镜的放大范围。分辨率介于光学显微镜与透射电镜之间，可达3nm。

　　(六) 电子束对样品的损伤与污染程度较小。

　　(七) 在观察形貌的同时，还可利用从样品发出的其他信号作微区成分分析。

　　二.扫描电镜的结构和工作原理

　　(一) 结构

　　1.镜筒

　　镜筒包括电子枪、聚光镜、物镜及扫描系统。其作用是产生很细的电子束(直径约几个nm)，并且使该电子束在样品表面扫描，同时激发出各种信号。

　　2.电子信号的收集与处理系统

　　在样品室中，扫描电子束与样品发生相互作用后产生多种信号，其中包括二次电子、背散射电子、X射线、吸收电子、俄歇(Auger)电子等。在上述信号中，最主要的是二次电子，它是被入射电子所激发出来的样品原子中的外层电子，产生于样品表面以下几nm至几十nm的区域，其产生率主要取决于样品的形貌和成分。通常所说的扫描电镜像指的就是二次电子像，它是研究样品表面形貌的最有用的电子信号。检测二次电子的检测器(图15(2)的探头是一个闪烁体，当电子打到闪烁体上时，1就在其中产生光，这种光被光导管传送到光电倍增管，光信号即被转变成电流信号，再经前置放大及视频放大，电流信号转变成电压信号，最后被送到显像管的栅极。

　　3.电子信号的显示与记录系统

　　扫描电镜的图象显示在阴极射线管(显像管)上，并由照相机拍照记录。显像管有两个，一个用来观察，分辨率较低，是长余辉的管子;另一个用来照相记录，分辨率较高，是短余辉的管子。

　　4.真空系统及电源系统

　　扫描电镜的真空系统由机械泵与油扩散泵组成，其作用是使镜筒内达到 10(4～10(5托的真空度。电源系统供给各部件所需的特定的电源。

　　(二) 工作原理

　　从电子枪阴极发出的直径20(m～30(m的电子束，受到阴阳极之间加速电压的作用，射向镜筒，经过聚光镜及物镜的会聚作用，缩小成直径约几毫微米的电子探针。在物镜上部的扫描线圈的作用下，电子探针在样品表面作光栅状扫描并且激发出多种电子信号。这些电子信号被相应的检测器检测，经过放大、转换，变成电压信号，最后被送到显像管的栅极上并且调制显像管的亮度。显像管中的电子束在荧光屏上也作光栅状扫描，并且这种扫描运动与样品表面的电子束的扫描运动严格同步，这样即获得衬度与所接收信号强度相对应的扫描电子像，这种图象反映了样品表面的形貌特征。第二节扫描电镜生物样品制备技术大多数生物样品都含有水分，而且比较柔软，因此，在进行扫描电镜观察前，要对样品作相应的处理。扫描电镜样品制备的主要要求是：尽可能使样品的表面结构保存好，没有变形和污染，样品干燥并且有良好导电性能。

　　一.样品的初步处理

　　(一) 取材

　　取材的基本要求和透射电镜样品制备相同，可参考第十四章超薄切片技术中所提的要求。但是，对扫描电镜来说，样品可以稍大些，面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

　　(二) 样品的清洗

　　用扫描电镜观察的部位常常是样品的表面，即组织的游离面。由于样品取自活体组织，其表面常有血液、组织液或粘液附着，这会遮盖样品的表面结构，影响观察。因此，在样品固定之前，要将这些附着物清洗干净。清洗的方法有以下几种：

　　1.用等渗的生理盐水或缓冲液清洗;

　　2.用5%的苏打水清洗;

　　3.用超声震荡或酶消化的方法进行处理。例如清洗肠粘膜表面的粘液，可用下面的方法：

　　清洗液配方：透明质酸酶 300 (gα—糜蛋白酶 10 mg生理盐水 100 ml清洗液的pH为5.5～6。清洗的方法是将样品浸泡在配好的清洗液中，边浸泡边震荡30分钟，最后用双蒸水洗3次。无论用哪种清洗方法，注意在清洗时不要损伤样品。

　　(三) 固定

　　固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。

　　(四) 脱水

　　样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，一般用醋酸异戊酯作中间液。

　　二.样品的干燥

　　扫描电镜观察样品要求在高真空中进行。无论是水或脱水溶液，在高真空中都会产生剧烈地汽化，不仅影响真空度、污染样品，还会破坏样品的微细结构。因此，样品在用电镜观察之前必须进行干燥。干燥的方法有以下几种：

　　(一) 空气干燥法

　　空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间;它的主要缺点是在干燥过程中，组织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用于表面较为坚硬的样品。

　　(二) 临界点干燥法

　　临界点干燥法是利用物质在临界状态时，其表面张力等于零的特性，使样品的液体完全汽化，并以气体方式排掉，来达到完全干燥的目的。这样就可以避免表面张力的影响，较好地保存样品的微细结构。此法操作较为方便，所用的时间也不算长，一般约2～3小时即可完成，所以是最为常用的干燥方法。但用此法，需要特殊仪器设备。

　　临界点干燥是在临界点干燥仪中进行的，操作步骤如下：

　　1.固定、脱水：按常规方法进行。如样品是用乙醇脱水的，在脱水至100%后，要用纯丙酮置换15～20分钟。

　　2.转入中间液：由纯丙酮转入中间液醋酸异戊酯中，时间约15～30分钟。

　　3.移至样品室：将样品从醋酸异戊酯中取出，放入样品盒，然后移至临界点干燥仪的样品室内，盖上盖并拧紧以防漏气。

　　4.用液体二氧化碳置换醋酸异戊酯：在达到临界状态(31(C , 72.8大气压)后，将温度再升高10(C，使液体二氧化碳气化，然后打开放气阀门，逐渐排出气体，样品即完全干燥。

　　(三) 冷冻干燥法

　　冷冻干燥法是将经过冷冻的样品置于高真空中，通过升华除去样品中的水分或脱水剂的过程。冷冻干燥的基础是冰从样品中升华，即水分从固态直接转化为气态，不经过中间的液态，不存在气相和液相之间的表面张力对样品的作用，从而减轻在干燥过程中对样品的损伤。冷冻干燥法有两种，即含水样品直接冷冻干燥和样品脱水后冷冻干燥。

　　1.含水样品直接冷冻干燥法

　　1.1 取材固定：按常规方法进行。

　　1.2 置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%～40%甘油水溶液。

　　1.3 骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150(C的氟利昂冷冻剂中，使样品中的水分很快冻结。

　　1.4 干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几小时或数天后，样品即达到干燥。

　　本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。

　　2.样品脱水后冷冻干燥

　　样品用乙醇或丙酮脱水后过渡到某些易挥发的有机溶剂中，然后连同这些溶剂一起冷冻并在真空中升华而达到干燥。和前一种方法比较，本方法的优点是不会产生冰晶损伤，且干燥时间短。不足之处是有机溶剂对样品成分有抽提作用，造成部分内含物丢失。乙腈(acetonitrile)真空干燥法：这是一种利用乙腈在急速蒸发时会冷却固化的性质将样品干燥的方法。其操作步骤如下：

　　(1). 固定、水洗：按常规方法进行。

　　(2). 乙腈置换：使用50%?70%?80%?90%的乙腈水溶液置换，最后用100%乙腈代替，每步骤15～20分钟。

　　(3). 干燥：至纯乙腈时，放入真空镀膜台抽真空，乙腈和样品在真空中很快致冷而被冻结(冻结的温度为(45(C)，变成冰状固体。然后继续抽真空，使冻结的乙腈升华，约需30分钟，样品即达干燥。

　　样品干燥后要粘在样品台上。对于不镀膜而直接观察的样品，必须用导电胶来粘固;对于要镀膜的样品，则可以用胶水或万能胶来代替，微细的样品如粉末、纤维等也可用双面胶纸来粘贴。

　　三.样品的导电处理

　　生物样品经过脱水、干燥处理后，其表面不带电，导电性能也差。用扫描电镜观察时，当入射电子束打到样品上，会在样品表面产生电荷的积累，形成充电和放电效应，影响对图象的观察和拍照记录。因此在观察之前要进行导电处理，使样品表面导电。常用的导电方法有以下几种：

　　(一) 金属镀膜法

　　金属镀膜法是采用特殊装置将电阻率小的金属，如金、铂、钯等蒸发后覆盖在样品表面的方法。样品镀以金属膜后，不仅可以防止充电、放电效应，还可以减少电子束对样品的损伤作用，增加二次电子的产生率，获得良好的图象。

　　1.真空镀膜法

　　真空镀膜法是利用真空膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热，当加热到熔点以上时，会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，在样品表面形成一层金属膜，使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒，有用铂或用金—钯、铂—钯合金的。金属膜的厚度一般为10nm～20nm。真空镀膜法所形成的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，目前已经较少使用。

　　2.离子溅射镀膜法

　　在低真空(0.1～0.01乇)状态下，在阳极与阴极两个电极之间加上几百至上千伏的直流电压时，电极之间会产生辉光放电。在放电的过程中，气体分子被电离成带正电的阳离子和带负电的电子，并在电场的作用下，阳离子被加速跑向阴极，而电子被加速跑向阳极。如果阴极用金属作为电极(常称靶极)，那么在阳离子冲击其表面时，就会将其表面的金属粒子打出，这种现象称为溅射。此时被溅射的金属粒子是中性，即不受电场的作用，而靠重力作用下落。如果将样品置于下面，被溅射的金属粒子就会落到样品表面，形成一层金属膜，用这种方法给样品表面镀膜，称为离子溅射镀膜法，图15(3显示该法的原理。

　　和真空镀膜法比较，离子溅射镀膜法具有以下优点：(1)由于从阴极上飞溅出来的金属粒子的方向是不一致的，因而金属粒子能够进入到样品表面的缝隙和凹陷处，使样品表面均匀地镀上一层金属膜，对于表面凹凸不平的样品，也能形成很好的金属膜，且颗粒较细。(2)受辐射热影响较小，对样品的损伤小。(3)消耗金属少。(4)所需真空度低，节省时间。

　　(二) 组织导电法

　　用金属镀膜法使样品表面导电，需要特殊的设备，操作比较复杂，同时对样品有一定程度的损伤。为了克服这些不足，有人采用组织导电法(又称导电染色法)，即利用某些金属溶液对生物样品中的蛋白质?脂类和醣类等成分的结合作用，使样品表面离子化或产生导电性能好的金属盐类化合物，从而提高样品耐受电子束轰击的能力和导电率。

　　此法的基本处理过程是将经过固定、清洗的样品，用特殊的试剂处理后即可观察。由于不经过金属镀膜，所以不仅能节省时间，而且可以提高分辨率，还具有坚韧组织，加强固定效果的作用。

　　组织导电法主要有碘化钾导电染色法、碘化钾--醋酸铅导电法、丹宁酸—锇酸导电法等。比较常用的是丹宁酸—锇酸导电法，其具体操作方法如下：

　　(1).样品处理：按常规方法取材、清洗及用戊二醛固定。

　　(2).导电染色：将样品放入2%～4%丹宁酸溶液中浸泡。如果观察表面结构，浸泡时间为30分钟;如果观察内部结构，浸泡时间为8小时，即可过夜。在浸泡过程中，可更换一次溶液。

　　(3).清洗及再固定：用磷酸缓冲液充分清洗，然后放入1%锇酸中固定2～4小时，再用磷酸缓冲液清洗。

　　(4).脱水和干燥：按常规方法。

　　(5).扫描电镜观察。

　　四.几种特殊的样品制备技术

　　(一) 细胞内部结构冷冻割断法

　　1972年，日本学者田中敬一采用冷冻树脂割断法将细胞打开，用扫描电镜观察细胞的内部结构。后来他又以二甲基亚砜代替树脂进行冷冻割断取得成功，该方法简便，结构清晰，已得到广泛应用。其操作方法如下：

　　1.取材和固定：为了使细胞结构清晰，不被过多的血细胞污染，可在取材前用灌注法冲洗。即先将动物麻醉，经腹主动脉注入生理盐水或低分子量的右,切开下腔静脉放血，至无血色为止。然后迅速取材，将样品修成1mm×1mm×5mm大小，投入1%锇酸溶液中固定1小时，用1/15M磷酸缓冲液 (pH7.4)清洗两次，每次10分钟。

　　2.二甲基亚 浸泡：将样品依次放入25%、50%二甲基亚砜溶液中，各浸泡30分钟。

　　3.割断：用TF—1型冷冻割断装置进行割断。然后将割断后的样品放到50%二甲基亚砜中，等融化后再用1/15M磷酸缓冲液浸洗，每次10分钟，换液5次。

　　4.软化及后固定：将样品放入0.1%锇酸中软化，温度20(C，时间48～72小时。然后用1% 八 固定1小时，双蒸水浸洗1小时，换液几次，需彻底清洗干净。

　　5.导电染色：将样品放入2%丹宁酸中2小时(或过夜)，以双蒸水清洗1小时，换液几次。再以1% 八 固定30～60分钟，双蒸水清洗1小时。

　　6.脱水、干燥及镀膜：按常规方法进行。

　　(二) 铸型技术

　　为了研究空腔脏器特别是血管系统复杂的立体分布，先向腔内注射某种成形物质，待该物硬化后再把组织腐蚀去掉，剩下的成形物即能显示血管系统的立体分布，这种技术称铸型技术。如果是研究血管系统，称为血管铸型。用铸型技术制作的标本，经过镀膜后，就可进行扫描电镜观察。

　　常用的铸型剂有甲基丙烯酸酯、聚苯乙烯及其共聚物以及ABS等。ABS是一种树脂，为丙烯晴、丁二烯和苯乙烯的三元共聚物，被认为是比较理想的铸型剂。下面简单介绍用ABS制作血管铸型标本的方法：

　　1.灌流和注入铸型剂

　　首先将准备灌注的器官取下或保持自然位置，找到动脉，插入玻璃管或静脉穿刺针，并以粗丝线结扎之，用普通流水或温盐水将血管中的血液冲洗干净。然后灌注铸型剂ABS丁酮溶液，浓度为5%～30%，注入的压力为100mmHg。注入铸型剂的脏器，可以放在50(C～60(C 的温水中浸泡6小时左右，这样既能保持脏器的原形，也有助于铸型剂的硬化。

　　2.腐蚀和清洗

　　将标本放入10%～20%氢氧化钠或氢氧化钾溶液中腐蚀，也有放20%～30%盐酸中腐蚀。时间一般为5～7天。若用稀盐酸腐蚀，可加入5%～10%胃蛋白酶，腐蚀的效果更好。然后用流水将血管铸型周围被腐蚀的组织冲洗干净，时间为24～72小时，冲洗的速度要慢。

　　3.显微解剖和剥制铸型

　　为了暴露和切取要观察的部分，需要在解剖显微镜下进行。如果铸型太硬，可将铸型浸入酒精中，加温至40～60(C，能使铸型变软，便于解剖和切取。

　　4.干燥和镀膜

　　将切取的铸型用蒸馏水洗干净，用滤纸吸干后放37(C温箱中30～60分钟，最后放干燥缸中保存。镀膜可用真空喷镀，也可用离子镀膜，方法同前。镀膜后就可用扫描电镜观察。

　　(三) 盐酸化学消化法

　　为了研究被观察细胞的基底面及深层细胞表面，可采用盐酸化学消化法制备样品。

　　1.固定和清洗：同常规方法。

　　2.盐酸消化：用8mol/L盐酸消化和腐蚀，其温度与时间根据不同组织而异。

　　3.清洁样品：用2%～5%Tween20作用3小时，以清洁样品和稳定其结构。

　　4.脱水、干燥和镀膜：按常规方法处理。