兔同种异体肌腱移植的电镜观察

　　【关键词】 肌腱

　　摘要： 目的： 观察分析同种异体肌腱(经深低温和普通低温处理)、自体肌腱、未经处理的同种异体肌腱移植后电镜下的微观变化特点，为同种异体肌腱移植提供理论依据。方法： 新鲜自体肌腱和未经处理的同种异体肌腱切下后立即移植于相应受体，同种异体肌腱分别经普通低温(-26℃)、深低温冷冻(-80℃)处理10 d 后移植于相应受体，移植后3周，取移植腱段，透射电镜下观察。结果： 深低温处理组：腱细胞增生活跃，数量多，细胞器发达，新生的细胶原原纤维较多，与自体肌腱移植组镜下观察结果比较接近;普通低温处理组： 腱细胞数量少，细胞器功能不发达，仍能见到少量的新生的细胶原原纤维;未经处理的同种异体肌腱组：偶见腱细胞，未见到新生的细胶原原纤维，粗胶原原纤维排列紊乱、疏松。结论： 经深低温冷冻处理的同种异体肌腱移植后与自体肌腱移植后的电镜观察结果接近，提示免疫排斥反应轻;普通低温处理的同种异体肌腱移植后电镜观察结果优于未经处理的同种异体肌腱移植，但又差于深低温冷冻处理的同种异体肌腱移植，提示仍存在明显的免疫排斥反应。

　　关键词： 同种异体肌腱; 移植; 普通低温; 深低温; 电镜观察

　　An observation on tendon allograft transplantation of rabbit with transmission electronic microscope

　　LI Jingyang, Aihemaiti, LIU Dapeng, et al

　　(Department of Orthopaedics, First Affiliated Hospital, Xinjiang Medical University,Urumqi 830054, China)

　　Abstract: Objective: To observe and analyse characteristics of microcosmic changes with transmission electronic microscope after tendon allograft transplantation. Methods: Fresh tendon auto grafts and fresh tendon allografts after incision were immediately transplanted into corresponding acceptor. Ordinaryfreezing tendon allograft which was frozen to -26℃ and kept 10 days, deepfreezing tendon allograft which was frozen to -80℃ and kept 10 days, then these two group providers were transplanted into corresponding acceptor. After three week, transplanted Achilles's tendons were harvested and immediately fixed by glutaraldehyde and observed under transmission electronic microscope. Result: Deepfreezing group: tenocyte proliferating was brisk, Its quantities was numerous, Intracell apparatus was up growth, a lot of rebirth and thin collagen fibril could be seen, similar to Auto graft tendon transplantation; Ordinaryfreezing group: a few tenocyte can be seen, intracellular apparatus function is inferior, but still a little rebirth collagen fibril was found; Fresh allograft group: No tenocyte, and few new collagen fibril could be seen, thick collagen fibril arranged at random and loose. Conclusion: Deepfreezing group's electronic microscope results is similar to auto graft group, Its immune rejective action was slight; ordinaryfreezing group was excelled beyond fresh allograft group, Its immune rejective action was obviously.

　　Key words: tendon allograft; transplantation; ordinaryfreezing; deepfreezing; eletronic microscope observation

　　骨科临床实践中常应用肌腱移植来进行修复重建。自体肌腱移植是传统的方法，但肌腱来源有限，供腱处的形态功能可受影响，从而限制了其应用。同种异体肌腱作为自体肌腱的替代，与自体肌腱有相同的结构和功能，而且来源广泛，特别是在多条或长距离肌腱缺损，而自体肌腱来源受限时，更显示出异体肌腱移植的优越性，经深低温冷冻处理后其抗原性大大降低，并可长期保存。陈星隆等[1]将普通低温处理的人类同种异体肌腱应用于临床，获得了成功。国内目前还没有人对普通低温处理的同种异体肌腱移植进行动物实验，为此我们开展了此项研究，旨在为临床应用提供理论依据。

　　1材料与方法

　　1.1实验材料

　　1.1.1实验仪器电镜(JEM100CXⅡ)，深低温冰箱(东芝)，普通低温冰箱(伊莱克斯)，1640培养基(Gibco)，FCS(杭州四季青公司生产)。

　　1.1.2实验动物与分组健康新西兰纯种兔60只，雌雄不均，4～6个月龄，体重1.5～2 kg，分笼单独喂养，由新疆医科大学动物实验中心提供。60只新西兰兔随机分为A、B、C、D、E、F 6组，每组10只。A组为深低温冷冻同种异体肌腱提供组，受体为C组;B组为普通低温冷冻同种异体肌腱提供组，D组为相应受体组;E组为自体肌腱移植组;F组为未经处理的同种异体肌腱移植组。

　　1.2方法

　　1.2.1移植方式A组提供经深低温冷冻处理的跟腱20条，经37℃水浴10 min 后移植于C组动物的左右下肢;B组提供经普通低温处理的跟腱20条，经37℃水浴10 min 后移植于D组动物的左右下肢。E组动物左右后肢跟腱互换移植。F组动物随机两两配对，然后将配对动物左右后肢新鲜跟腱相互移植。

　　1.2.2肌腱的处理(1)深低温冷冻处理: A组供体跟腱切下后用生理盐水反复冲洗3遍，洗去血迹，放入含10%胎牛血清(FCS)的1640培养液中浸泡30 min ，然后置无菌密封容器，先放入4 ℃ 冰箱平衡1 h，再置入-80 ℃ 深低温冰箱,逐步降温10 d 后待用。(2)普通低温处理：同法取跟腱经预处理后，置无菌密封瓶，先放入4 ℃ 平衡1 h ,再放入-26 ℃ 冷冻10 d 后待用。(4)新鲜自体和异体移植肌腱：取下跟腱，经生理盐水反复冲洗，洗净血迹后即用于移植。

　　1.2.3手术过程将兔双下肢皮肤用脱毛剂脱毛，清水洗净。5%硫贲妥钠(1 ml/kg)腹腔麻醉，俯卧位固定，消毒铺巾，小腿后侧切口处2%普鲁卡因局麻，显露跟腱全长，上方于腱腹交界处切断，下方于跟腱止点上0.5 cm 处切断，供腱长2 cm。受体兔跟腱切去2 cm长，缺损处用于移植供腱。移植用0/5爱惜康线，吻合端“8”缝合，0/8线间断加强，保持吻合端平滑，腱束不外露。吻合后保持吻合口无张力，切口以0/1丝线连续缝合，伤口不包扎，术后肢体不制动，不给予抗菌素预防感染，不给予免疫排斥药物，分笼喂养，任其自由活动。

　　1.2.4移植后处理跟腱移植3周后取移植肌腱,先后用4%戊二醛、1%锇酸固定，丙酮梯度脱水，EPON812环氧树脂包埋，铅铀双重染色，JEM100CXⅡ 透射电镜观查。

　　2结果

　　2.1C组(深低温组)电镜下所见胶原原纤维周期性横纹均匀规律清晰，胶原原纤维大多呈平行排列,腱细胞胞质较厚,可见大量微丝、游离核蛋白体和粗面内质网,腱细胞较多,核呈分裂相,核膜消失,染色质集聚于细胞中央,腱细胞间可见排列粗细基本一致的粗胶原原纤维;细胞内外可见到大量细的、新生的、不规则排列的胶原原纤维;少数细胞可见核周隙轻微扩张,细胞内可见髓样小体,线粒体、粗面内质网扩张,线粒体有空泡变。总体印象:细胞功能较发达,细胞器丰富,细胞器有受损表现,细胞增生活跃。

　　2.2D组(普通低温组) 电镜下所见腱细胞数量少,胞质较少,细胞多呈不规则形,细胞核皱缩,粗面内质网、游离核蛋白体和微丝少见,胞内可见较多空泡(可能为线粒体或内质网空泡变形成)，胶原原纤维排列基本整齐,粗细较均匀,周期性横纹清晰,在较粗的胶原原纤维之间可见少量细的胶原原纤维。总体印象:细胞数量少,细胞器不发达, 细胞器受损严重，功能差,但尚能生成胶原原纤维。

　　2.3F组(未经处理的同种异体肌腱组)电镜下所见胶原原纤维排列紊乱、松散,偶见腱细胞,胶原原纤维粗细基本一致,未见新生的细的胶原原纤维,横纹周期紊乱，腱细胞核膜皱缩、不规则,线粒体模糊,内质网扩张,颗粒少,内质网及线粒体数量极少,核内异染色质多。总体印象:细胞功能极差,无新生的胶原原纤维生成。

　　2.4E组(自体移植组)电镜下所见胶原纤维与腱细胞形态结构与深低温冷冻组基本相同。不同点:细胞内无髓样小体,无空泡变性的细胞器。

　　3讨论

　　异体移植中引起免疫排斥反应的是主要组织相容性抗原,这些抗原必须经过抗原呈递细胞(APC)将这些抗原分子呈递给T细胞,才能启动宿主对抗移植物的排斥反应,而移植物残留的APC是触发排斥反应的关键因素。Minami等[2]通过补体依赖性细胞毒试验和吸收实验，确定异体肌腱的抗原性主要存在于其腱细胞成分,主要是组织相容性抗原(HLA)。目前，冷冻处理能降低肌腱免疫原性的这一结论已获得国内外的广泛共识。据文献[3,4]报道,冷冻处理的异体肌腱基本被看作是一种极轻度或无免疫原性，使受体可以接受而不会产生明显的排斥反应。其机理是：冷冻破坏或改变了腱细胞表面的抗原结构，使其抗原性大大降低的同时，也杀死了对低温敏感的抗原呈递细胞，因此免疫反应得以减弱。王磊[5]研究发现，人和大鼠脾脏树突状细胞在冷冻速率提高时,存活率下降,在以20℃/min 速率降温时,存活率低于10%,在以70℃/min 速率降温时,冷冻后无活性树突状细胞存在，而树突状细胞是一种最重要的抗原呈递细胞。 有研究认为，深低温冻存的肌腱，其血管化比冻干肌健快，原因是腱组织中有活细胞存在，移植后借助周围组织液营养及两端血管的迅速长入，使存活细胞分裂增殖，参与修复，肌腱愈合较冻干腱要快[6~8]。但鲁晓波等[9]的实验发现，经冷冻/冻干处理能降低异体腱组织的抗原性，但仍可导致免疫排斥反应发生，异体腱的免疫排斥反应以受区局部组织较严重，异体肌腱细胞的组织活性保存得越好，其抗原性则越强。 器官移植后急性排斥反应多发生于移植术后2～4周[10]。本实验于移植术后3周进行电镜检查,是了解移植局部状况较佳时期。本实验通过电镜观察到：(1)深低温冷冻处理的肌腱移植后与自体肌腱移植结果基本相似。一方面说明经深低温冷冻处理的异体肌腱免疫排斥反应降低，另一方面说明处理后的肌腱与受体具有相容性，抗原性低。不同点：深低温冷冻处理移植的肌腱细胞内有髓样小体，空泡变性，显示有细胞器受损，分析受损原因，可能是受体腱细胞迁移到植入腱时，有轻度排斥反应发生。(2)普通低温处理组表现为细胞数量少，新生胶原原纤维数量少，胞质不丰富，细胞器少。分析其原因可能是：①普通低温(-26 ℃)未能杀死全部抗原呈递细胞，导致免疫排斥反应发生;②受体腱细胞迁移进入植入腱时，排斥反应重。(3)未经处理的同种异体肌腱组表现为胶原原纤维排列紊乱、松散，无新生的细胶原原纤维形成，腱细胞非常少，胞质内细胞器非常少，这均是免疫排斥反应的直接结果。陈星隆等[1]认为普通低温处理已能够使腱细胞或细胞表面的抗原结构发生改变。但本实验的结果显示，普通低温处理的异体肌腱移植后有明显的排斥反应发生，经深低温冷冻处理移植后的肌腱，免疫排斥反应轻。因此临床应用普通低温处理的同种异体肌腱时应慎重。作者认为，临床进行同种异体肌腱移植时，应首选深低温冷冻处理的肌腱。

　　参考文献:

　　[1]陈星隆,高伟祖,洪建军，等.普通低温冷冻保存异体肌腱的应用研究[J].中华手外科杂志，2001,17(4)：223224.

　　[2]Minami A, Ishi S, Agino T, et al. Effect of the immunological antigenicity of the allogeneic tendons on tendon grafting[J]. The Hand, 1982,14:111119.

　　[3]张友乐,杨克非,高新生,等.冷冻干燥异体肌腱移植的实验研究与临床应用[J]. 中华骨科杂志，1997，17(1)：5962.

　　[4]Cameron RR. Freezedried composite tendon allograft:An experimental study[J]. Plast Reconstr Surg, 1971,47:39.

　　[5]王磊.同种异体组织冷冻保存和移植的研究[J].国外医学骨科学分册,2002,23(1)：3335.

　　[6]Ready AR, Jenkinson EJ, Kingston R, et al. Successful transplantation across major histcompatibility barrier of, deoxyguanosinetreated embryonic thymus expressing class 2 antigens[J]. Narure,1984,310(19):231.

　　[7]唐林俊，雷军，程国良.超低温处理的异体肌腱移植[J]. 中华手外科杂志，2001,17(增刊)：13.

　　[8]王锡阳，李康华，王卫国.同种异体肌腱移植的实验研究[J].湖南医科大学学报,2000，25(2)：138140.

　　[9]鲁晓波,杨志明. 冷冻小鼠同种异体肌腱移植后IL2生物活性水平的测定[J].中华手外科杂志,1999,1:17.

　　[10]张小榕.器官冻存与移植排斥反应[J].国外医学免疫学分册，2000，23(2)：6870.

　　(新疆医科大学第一附属医院骨科， 新疆乌鲁木齐830054)