实验中如何维持细胞活性!（活细胞成像专题之六，Microimage 译）

　　现在的研究开始更多的关注细胞的生命过程，这就需要进行活细胞成像实验，那么，如何在实验过程中维持细胞的活性就成为一个重要的问题。

　　在实验过程中，需要对环境进行严密的监控，这包括物理参数，培养小室，温度，大气，营养供给，培养液pH， 渗透压等。Figure 1 中的几种不同的细胞分别使用了不同的荧光染料进行荧光成，与DIC 成像原位叠加后，可研究细胞的边界，以及内部的结构，如细胞核。

　　进行活细胞成像时要注意的因素有很多，如标记样品的探针特异性要高，细胞培养过程要稳定，成像时要有足够的时间及空间分辨率而又要避免细胞光毒性。细胞培养时最重要的温度，氧含量，湿度，渗透压，pH， 光毒性，实验室环境，显微镜焦点漂移，荧光信号强度，分辨率等。

　　活细胞培养需要控制二氧化碳及温度，但是用于长时间成像的培养室的要求则更多。这种小室在实验过程中必须稳定，并且允许试剂添加，并且不会扰乱时序实验的进行(如焦点漂移，载物台移动等)。另外的要求还包括简洁，可靠，价格合理。虽然对各种不同的细胞来说实验技术林林总总，但是，用于培养的小室则大同小异。我们下面以哺乳动物为例讲述活细胞成像试验中，细胞活性的维持。

　　培养基

　　早期的培养基为包含了胚胎提取物，血清，蛋白及其他体液成分的混合物。由于生化方面的要求，培养基的成分迅速明确起来，包括(Eagle’s Basal)EBM，(Minimal Essential) MEM, (Dulbecco's modification of MEM)DMEM, (Ham's media )F-10 and F-12, 以及两种配方精密的(Roswell Park Memorial Institute )RPMI 1640 及RPMI 199，另外还有无碳源培养基Leibovitz L-15。以上这些培养基都需要加入血清，加入量在5-20% 范围内。无血清的培养基是转为特定的实验而设计的限制性培养基。

　　培养基的组成多种多样，不过大多数都包括氨基酸，维生素，无机盐，微量元素，核酸组成物，糖，辅酶，脂类，三羧酸循环中间体，及各种生物素。如MEM 这样简单的培养基包括了必须氨基酸，维生素，盐，而更为复杂的培养基如RPMI 及无血清培养基则包含了上百种组成成分。培养基随实验要求而有所不同，这些可变因素包括pH， 缓冲容量，氧含量，渗透压，粘度，表面张力。在成像试验时，这些因素都必须小心维持。

　　大部分细胞只适应相当窄的pH 范围在7.2-7.4之间，成纤维细胞适宜pH 值为7.7，转化细胞在7.0。大部分商品培养基都含有指示剂酚红。酚红在pH7.4为亮红色，在pH7.0为橘红色，在pH6.5为黄色，由于酚红随pH 值改变颜色十分明显，所以是一种十分便捷的指示剂。但是由于它会增加背景噪音及光毒性，因此在活细胞荧光成像试验中不适用。现在已有很多不含酚红的固体或液体培养基。

　　事实上，细胞培养过程中需要二氧化碳及重碳酸盐来控制pH，而且大气中也要有少量的二氧化碳，这些要通过专业的小室来严格控制大气中的二氧化碳组成。由于有些细胞需要在二氧化碳存在的条件下才能生长，因此添加生物缓冲液如TRIS，HEPES 可以明显降低细胞对二氧化碳的需求。10-20 mmol HEPES 可将pH 控制在生理范围内，但是为了细胞更好的生长，仍需向培养基中添加碳酸钠。

　　HEPES 的使用将降低细胞的生长速度(尤其是在长时间培养中)，HEPES 值会降低pH 的漂移速度，并不会消除培养基内积累的碱。而且HEPES 在活细胞成像实验中表现出毒性。Leibovitz L-15 是专为消除二氧化碳而设计的，它含有丙酮酸钠，能够增加二氧化碳的产量。

　　细胞对氧气的需求量变化很广，哺乳动物一般需要氧气来进行呼吸作用，但有时也可通过糖酵解来代替这一过程。培养基的深度会影响氧气的溶解量，一般贴壁细胞的培养基不宜超过5mm。降低氧含量还有助于降低荧光成像时的光毒性(自由基的生成)，但是氧含量过低对细胞也是有害的。通用的降低氧含量的方法是添加抗坏血酸，维生素C，Trolox(维生素E的衍生物)，但同时也要降低照明强度，并使用高感度相机。

　　细胞适宜的渗透压强度在260-320mol之间，当细胞在开放小室或培氏培养皿中培养，当使用低渗培养基以补充蒸发带来的影响。当添加细胞或更换培养液时要格外注意避免蒸发。所以，实验中最好使用封闭小室，或在开放小室中在培养基上覆盖一层矿物油，或在成像过程中使用湿度控制小室。需要注意的是小体积的活细胞成像培养小室提供的微环境不如二氧化碳温箱的稳定。

　　活细胞成像细胞系的选择

　　细胞系的选择由一系列因素决定，包括研究目的，细胞对荧光标记的适应能力，转染效率，对于培养小室严密的环境条件及照明条件是使用能力。选择的主要因素是所选的细胞系能否在形态学及生理学角度很好的展示研究所要结果。如下表：

　　活细胞成像小室的选择

　　由于前篇文章已详细阐述，故这里不再赘述。

　　Figure 2(a) 中为加热成像小室，Figure 2(b)为安装在Nikon TE-200 倒置显微镜上的培养箱。

　　温度控制

　　在活细胞城乡试验中，使系统的温度与周围环境有明显的区别是和困难的。细胞的功能受温度的影响很大，现在有很多系统可配合小室一起来控制温度。但是，对温度的控制常常受小室及其配件限制，是温度无法恒定。最温度恒定影响最明显的是载物台，机身，及物镜。其中油镜及水镜对温度的影响更为明显。物镜下的区域温度可能会比周围低5℃。

　　但是，即使有物镜加热装置，在样品及前透镜之间仍存在温度梯度。Figure 3(a)及Figure 3(b)，中为两种通用的物镜加热模式图。前者采用电加热，后者采用液体加热。很多物镜都是为固定样品的观察而设计的，由前可知而这种物镜并适用于活细胞成像实验。所以选择活细胞成像用物镜时要格外注意它的加热效率。对物镜的加热会改变盖玻片位置，从而倒置样品漂移到焦点外。有人认为加热物镜会缩短它的使用寿命，但事实上并没有这方面的报道，加热物镜唯一的影响是加热会导致外套润滑剂粘度的增加。这样，镜油就可能进入外套，养成润滑剂的使用寿命。

　　对一个永久性的装置，可以在显微镜上安装一个大的箱子，并采用热空气加热。这样避免了热效应对显微镜组件造成的损伤。对于这种密闭装置，可调节部件要尽量的少，造价要低，并且要准确控制真个实验室的温度。由于这种装置由很多不同材料构成，因此要避免热效应对焦点及漂移的影响。对长时程观察来说，可采用恒温箱或将整个显微镜安放在37℃的恒温实验室中。其中对于具体的实验，在进行不同的选择，但是，最为重要的还是活细胞

　　需要考虑的实验室环境因素

　　在活细胞成像试验中，实验室的通风要好，以便于排除臭氧，及其他有机溶剂的挥发物。另外，实验室的空间要足够大，以容纳整个显微镜系统，而且，实验室要保持清洁整洁，避免灰尘，烟雾或其它有害气体损害光路。显微镜台及周边区域要用70% 酒精擦拭。培养液的溅出也是不可避免的问题，液体溅出后要立即彻底地清除溅出区域及周围区域。中央供热及制冷系统产生的震动会影响显微镜的性能。现在有很多种技术可以降低低频震动，包括反馈控制隔振台，以及由聚合物制成的和震垫。(如图Figure 4)将隔振垫及半英寸铝板结合制成的隔振台可将震动降低到不可见的水平。在桌面上放铅块等重物也可降低震动。其他可为实验带来好处的还有在夜间或早晨等安静的时刻进行试验。

　　另外，风扇，管道，以及灌流时的气泡都会产生振动及噪音，从而影响高分辨率成像实验。因此，要尽能的将这类设备安置在另一件屋子。显微镜一般都带有内置光源，这些会逐步加热机身，倒置焦点漂移。

　　对于时序实验来说，实验室的温度也是一个重要的问题，一间通风不佳的小实验室会因为使用显微镜而导致温度上升。随着温度升高，电子元件的性能会下将，而且会产生振动及灰尘，同时会影响电脑的性能，严重的情况下会导致资料的丢失。因此添加制冷系统是必要的。

　　倒置显微镜要比正置显微镜的防震性能好，但是在活细胞试验中，转换滤色片，高速光闸的开关都会引起明显的震动，对此最佳的处理方法是使用带有钻孔的铝板以及将这些会产生振动的部件安置在不同的支架上。

　　焦点的漂移

　　时序试验中，由温度引起的焦点漂移及焦平面的改变是一个常见的问题。引起这一问题的因素有很多，比如不规则的盖玻片表面，不规则的齿轮滑动，润滑剂的压缩，显微镜可用部件的转动等。对于短时实验来说，使用恒温装置可解决这个问题，但对于长时间实验，则效果不佳。

　　在配置显微镜的时候，需要注意显微镜，相机，光闸，绿色块转轮，照明装置，活细胞培养小室，主计算机都要持续工作24-48hrs，因此，要确保培养小室中附有细胞的玻片要安装准确，小室安装后不可有位移，使用油镜或水镜时物镜要带有加热器。一旦这些都安置好，那恶魔实验时的稳定性就会相当的好。另外还有很多软硬件商品可以防止这方面的问题，比如自动对焦系统，可以通过感光或声音反射自动调整工作距离。但是这一系统不适用于水镜及油镜。

　　将软件与自动对焦系统结合，可自由的设定焦平面。激光机LED 光源采用长波长近红外光，不会干扰明场或荧光观察。

　　Figure 5 展示了自动对焦漂移校正系统的工作原理，以及用于检测的红外线在光谱中与常用荧光素普带范围的位置关系。

　　光毒性及光损伤

　　除了荧光子本身以及过表达的荧光蛋白，由光介导的损伤(光毒性)也会在荧光反复激发的过程中出现。它们会生成自由基，导致亚细胞组成的改变，最终危害整个细胞。由于荧光蛋白的发光基团倍肽链包裹，所以它并不会为细胞带来伤害，然而人工合成的荧光素如MitoTracker及核染料(Hoechst, SYTO cyanine dyes, 及DRAQ5)即使短时间激发，仍具备高细胞毒性的。所以，在设计这类实验时，最好选择激发波长长的荧光子，以降低短波长对细胞的伤害。

　　Figure 6 展示了人工合成的荧光子受到激发后对细胞的损害。Figure 6(a)中为转入EGFP基因的兔肾细胞，数小时后开始出现包含线粒的空泡。Figure 6(b)为人表达mChenry 的U-251细胞与β珠蛋白融合数小时后的照片，细胞结构已发生明显改变。Figure 6(c)中为DNA　结合型染料处理数小时后的3T3 细胞系。紫外吸收的核染料的光毒性效果要比长波长染料快得多。

　　前面已提到HEPES 具有细胞光毒性，但是，需要注意的是细胞本身对光就是敏感的，荧光子等物质只是加深了光毒性的作用，由荧光子生成的自由基只能限制，并不能避免。健康的细胞具有消除自由基的酶系统。降低氧含量可是细胞光漂白及自由基的生成量降低到最低限度。

　　除了上述因素，还应尽量减少曝光时间，如荧光光闸的使用，尽量减少不必要波长的光的照射，使用高数值孔径的物镜时，要尽量降低照明强度。

　　即使在无荧光子存在的情况下，细胞仍会受到紫外线的伤害，这一现象称光损伤。为了避免这一现象，在活细胞成像时，最好在最低的光强度下观察，而且速度要快，在光路中要加入中灰度滤色片，并使用数字成像系统，定位细胞时使用明场，相差，DIC 等方法，并且在光路中添加绿光片或红光片以减少细胞在蓝光中的曝光。

　　在活细胞研究中，绿光无法提供足够的照明强度，而且现在的物镜经校正后不需绿光来提高分辨率。对大多数细胞来说，红外及紫外对细胞伤害最大，红光对细胞的伤害最小，因此，带通为600-650nm 的红光片是非常适合的。需要注意的是分辨率与光的波长有直接关系，所以，红光下的分辨率是可见光中最低的。但是由于活细胞成像实验中细胞运动，温度变化，光学系统的缺陷，以及照明的不稳定等因素影响，这一分辨率的差距几乎对实验没有什么影响。

　　随着技术的发展，如共聚焦显微镜，CCD 感光性强的设备可以探测记录十分微弱的信号。如果没有敏感度高的相机，也可以通过binning 处理来放大信号，不过这样做会损失一定的空间分辨率。在共聚焦显微镜中，低放大倍数下，对细胞的光毒性要比高倍数小小很多。

　　研究参数未知的细胞系时，首先要将光强降到最低，给予非常短的曝光时间，来获取图片，1.0 的中灰度滤光片的曝光时间大概在100ms 或更短。相对于共聚焦显微镜，激光强度设定在1% 左右，增大增益电压，曝光时间缩短到平时同类样品的一半。如果细胞能长时间耐受这样的条件，那么这一强度的照明是适宜的。需要注意的是，细胞能够耐受的光强与曝光时间的关系是非线性的。短时间曝光对细胞伤害不大，但长时间(大于1.5s)连续曝光对于细胞来说则是致命的。

　　细胞活性及变异

　　将培养小室安装好之后，下面的工作就是观察细胞并选定适宜的细胞尽享拍摄。经过转化的细胞，如转入荧光子的细胞通常会发生形态学上的改变，会影响细胞的健康，如解粘联，形成大量空泡，线粒体胀大，细胞质成泡。这些现象可能代表着细胞活性的降低。这类有变异的细胞不适合成像及研究，另外，如果整体多于50% 的细胞都发生的变异，那么这个整体就应该弃掉重做。

　　活细胞的形态随表型而变化，因此细胞的表现可能为处在不同的生长时期，或表现为内在的不同。因此，研究者当记录整个群体的数据，以得到统计学上的结果。如前，成像的条件要保证将对细胞的干扰降到最低，并且，维持细胞的健康状态。

　　实验的条件不可对细胞的生长速度，有丝分裂指数，凋亡特性等造成影响，试验中任何的负面影响，如果可能，要分别进行评估，最后要确保细胞在小室中可以耐受长达数小时的成像实验。这样，将各个因素分开考虑，并可分别进行调节。

　　如前所述，在活细胞成像实验过程中，细胞曝露于高剂量光照下，用于标记的荧光子等物质会生成损害细胞功能的分子，所以，试验后要估算细胞在实验过程中是否受到了损害。估算方法为在实验结束后将细胞放在载物台上，观察细胞是否开始调往或进行有丝分裂。这一过程可以通过时序实验记录。

　　调往是用于衡量细胞是否发生变异的标准。在成像实验结束后，要用健康细胞比较实验细胞的形态及表面健康状况是否收到了影响。通常使用相差或DIC 来衡量细胞的健康状况，用荧光观察来比较细胞中的荧光标记是否发生了位移。以上的观察要间歇性的持续几个小时以断定在成像后，细胞是否出现了明显的损伤。

　　检验细胞的有丝分裂是一种鉴定细胞光损伤的方法。受到过度光照后，细胞染色体在前期开始凝集，细胞不会进入前中期，但会完成整个分裂过程。如果在观察过程中，染色体发生解凝集，则有可能发生了光损伤。需要注意，更换培养基也会导致染色体解凝集。细胞在分裂时对光的耐受是不同的，初级培养物及人，动物细胞对光是十分敏感的，而从胚胎分离出的细胞即使DNA 受损仍能继续分裂。

　　活细胞试验中另一个重要因素是污染。污染源包括细菌，真菌，原生质，酵母，霉菌，以及较少见的原生动物。相对来说，生长迅速的微生物的影响并不大，因为它们很容易被检测到，比较麻烦的是那些由于尺寸，以及其他因素而不易被检测到的生物。使用过多的抗生素虽然能降低污染的水平，但是这样一来，将有长时间无法检测到的污染存在于培养物中的可能，而这些污染物将会一直影响哺乳动物细胞的功能。

　　Figure 8 中为常见的三种污染源，Figure 8(a)为细菌，这种微生物在高放大倍数下可见，而且会迅速降低培养基pH，在增值到一定数量后肉眼可见。Figure 8(b)中为酵母，这种微生物有特定的菌落形式。Figure 8(c)中为霉菌，这种微生物在生长24-48hrs 后即可占满整个培养物。也许最为严重的污染要算那些无法用增衬显微术(如相差及DIC)检测出来的微生物。支原体，一种会影响细胞行为及新陈代谢的污染源。活细胞成像中要绝对杜绝这种微生物的存在。用于检测支原体的技术有荧光印记，多聚酶联反应，以及放射性自显影。

　　总结

　　活细胞成像实验是一个强有力的研究手段，与固定细胞研究结合起来，可以解释活细胞中的多种生命现象。随着仪器设备的改进及技术的提高，活细胞实验已得到了很大的改进，但很多问题仍有待解决。