活细胞成像—专家分析（Microimage译）

　　科技聚焦

　　以前的细胞生物学家从来没有像现在这样，有这么多的工具研究细胞内部到底发生了什么变化。即使是新手也可以用活细胞成像系统来方便快速的观察样品。近年来随着数据存储和组织能力的增强，慢速拍摄技术也在逐步提高。

　　尽管近年来发展迅速，但是活细胞成像系统仍然有很大的发展空间。“活细胞成像系统的真正核心是使研究人员理解细胞中的分化‘决定’过程，同时在实时条件下观察这一过程，”CELLASIC的总监 Philip Lee这样说，“我们开始在合成生物学中使用活细胞成像观察。在这个领域中，一些很复杂的细胞功能可以很清楚地通过活细胞观察到，来分析一些基本的表型。下一步的目标是活细胞观察研究动态的过程。”根据动态过程发生的速度，可能需要一些研究方法，例如快速的图像捕捉和更慢的慢速拍摄。今天的活细胞成像工具，可以使研究人员看得“更深、更快、更长久”。

　　“看得更深”

　　研究人员想研究单个或者表皮细胞，以及细胞内部组织的需求现在可以实现了。“活细胞成像的重要的新技术是将多光子技术和全内反射荧光显微镜技术结合在一起，”奥林巴斯美国公司激光共聚焦部门经理Dennis Donley说，“这个领域在逐步的发展，主要是因为科学家想同时观察表面的特征和细胞内部动态过程。”奥林巴斯Fluoview FV1000-EVA结合了各种显微镜的特征于这款产品中。在Fluoview FV1000-MPE产品中，奥林巴斯也结合了多光子技术来研究更深层的细胞结构，还可以同时从样本两个不同区域同时感光。拥有脉冲飞秒红外激光和奥林巴斯长工作距离UIS2物镜，Fluoview FV1000-MPE可以拍摄样品深度达几百微米。

　　Andor公司也采用了包括TIRF在内的革新系统用于表面细胞研究，同时该系统还有其他特性。这个新的系统同时集合了碟片共聚焦、TIRF和LED-照明的宽视场图像模块。最新的系统中还包括FRAPPA。荧光漂白恢复技术(FRAP)和光激活技术(PA)已经用于成像技术中，在该技术中，可以用计算机操作的激光束用来对用户指定的样品区域进行光漂白和光激活。在多种成像模式中使用同一激光光源，Andor采用了一种多端口转换技术(MPS)。MPS采用快速敏感电流计在1ms内调整输出电流，外部用TTL控制。

　　“看得更快”

　　拍摄快速细胞活动的图像或者更快的渲染图像的技术已经大大提高。举个例子来说，Improvision (现在为PerkinElmer公司一部分)开发了新型UltraVIEW VoX碟片共聚焦成像系统，还配有3D/4D的Volocity图像软件，可以更快速的获取图像。Improvision市场部经理Nicky Francis说，“UltraVIEW VoX结合了ProSync专利技术，该技术可以提供高速的图像捕捉性能，降低图像的虚影，提高对样品的保护，因此UltraVIEW VoX可以提供最好的高速3D活细胞成像观察。UltraVIEW VoX系统有Volocity图像软件支持，提供从图像获取到图像发表的一系列的技术工具，包括3D/4D分析。”

　　在高容量筛选的快速成像中，PE公司的 new Opera和 Opera LX的高容量筛选酶标仪结合Acapella图像分析软件，在分析过程中对细胞产生的伤害很小。Nipkow式的旋转盘，内含共聚焦用增强针孔阵列的微镜头，这两者组合是高容量筛选的不二选择。它可以高速成像同时将光毒性和光漂白降到最低。PE new Opera和 Opera LX这两款产品可以模拟细胞生长环境,控制温度、湿度和CO2浓度。为了能进行长时间的多种参数测定，这两款产品还提供了一个完整的活细胞工作平台，包括外部培养箱和平板操作平台。高通量活细胞筛选可以大规模在这款产品中实现，包括平板读取、储存、培养，组成和试剂的液体操作，平板洗涤和离心等。

　　“看得更久”

　　实际上，一些可以提供长时研究例如时间序列实验的系统，对细胞生理学的复杂过程的观察起到至关重要的作用。Molecular Devices的市场部总监Michael Sjaastad说，“多通道的延时研究在新药发现研究中有着非常重要的意义，那些可以在一段时间内保持培养条件的系统可以使二次筛选成为可能。系统开发最大的挑战是，硬件在不同的培养条件下的正常运行、和控制多维和延时数据的软件的配置。”Molecular Devices的ImageXpress Micro高通量筛选系统就满足了上述的条件。

　　活细胞的延时研究同时受益于微流体技术的发展。CellASIC在ONIX 动态细胞培养平台的活细胞成像上就运用了微流体技术。在微流体培养室中，培养的细胞在成像过程中受到持续不断的灌注和环境的改变。“目前的微流体板已经可以跟市面上的所有倒置显微镜兼容，这对涉及到某些刺激的动态研究的过程尤为有用，比如被生长因素、诱导物和药物诱导的基因表达、蛋白定位。”Lee解释说。

　　Lee希望以微流体技术为基础的系统，有助于在延时研究中细胞培养条件的标准化。“诸如温度，pH，剪切速率，细胞培养表面，培养基中细胞浓度，培养基更换方法等等在不同的实验中都有很大的差异，”Lee说。“以微流体技术为基础的细胞培养技术对细胞体外实验的研究有巨大的革新意义。不仅仅因为该技术在细胞培养环境中培养条件控制的准确性，它还可以使更多的细胞的生理行为在体外重建。”

　　总结

　　“看得更深，更快，更远”——始终有一天我们可以全部同时做到，当然只要我们有足够的空间储存数据。“将共聚焦部分，TIRF，FRET和电生理记录功能整合到一个系统中，这样还可以满足数据处理和多维图像渲染的高需求，”Coates说。“在软件方面，强大的语言如Python，已经开始在生物数据处理上逐渐应用并产生影响。”我们希望电脑可以跟上系统发展的挑战。